Os autores gostariam de agradecer Julia Hatler e Martin Ramsden (R &amp; D Systems) para discussão útil e revisão do manuscrito.

1. Indução de EMT <ol><li> Meios de cultura de aquecer a 37 ° C em um banho de água. O meio de cultura utilizado é o mesmo que os meios utilizados para a cultura padrão de suas células de interesse. Por exemplo, a linha de células de pulmão humano A549 carcinoma é cultivado em F12 de Kaighn suplementado com 10% de soro fetal bovino e glutamina 2 mM. </li><li> Células colheita de interesse usando uma solução de dissociação (por exemplo TrypLE Express). </li><li> Suspender as células em meios de cultura pré-aquecido em um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 400 xg durante 5 min. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante por derrama em um recipiente de resíduos. </li><li> Suspende-se o sedimento de células em meio de cultura de pré-aquecido. </li><li> Contagem de células viáveis ​​utilizando azul de tripano. Retirar uma amostra de suspensão de células e dilui-se em 0,4% de solução de azul de tripano. Coloque 10 ml da amostra diluída em um hemocitômetro e contagem de células viáveis ​​(células que não ficam azuis). Utilizar a contagem de células para determinar a célula density em sua solução. </li><li> Células placa sobre placas de cultura de tecidos tratados ou frascos de 0,9-1,0 x 10 4 culas por cm 2. Por exemplo, 0,5 x 10 6 células plaqueadas numa placa de 100 mm de meio de cultura contendo 1X Suplemento EMT Indução de media (6 ml de meio por placa de 100 mm). </li><li> Cultura de células plaqueadas numa 37 ° C / 5% de CO2. Monitorar morfologia celular diariamente. </li><li> Três dias após o plaqueamento, remover e substituir a mídia com meios de cultura pré-aquecido fresco contendo 1X EMT Induzir Mídia Suplemento. Continuar a cultura em um 37 ° C / 5% de CO2. </li><li> Cinco dias após o plaqueamento, as células estão prontas para análise. Morfologia celular é visualizado por microscopia de luz invertida. </li></ol> 2. Análise da expressão das proteínas por imunocitoquímica <ol><li> Prepare estéreis lamelas 12 milímetros para uma placa de 24 poços colocando lamelas numa placa de petri contendo 95% de etanol. Remova cuidadosamente lamelas de etanol nosção de uma agulha e uma pinça curva e chama esterilizar. Coloque lamela esterilizada para um poço de uma placa de 24 poços. Repita com lamelas restantes. </li><li> Prepare a suspensão de células como descrito na seção 1,1-1,7. </li><li> Placa 1,6 x 10 4 células / poço em 0,5 ml de meio de cultura pré-aquecido contendo 1X EMT Induzir Mídia Suplemento. </li><li> Crescer e alimentar as células, conforme descrito nas seções 1,9-1,11. </li><li> Cinco dias após o plaqueamento, retirar o suporte e fixar as células com 300 ^ l / poço de paraformaldeído a 4% em 1X tampão fosfato salino (PBS) durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover fixador e lavar as células 2x com 1X PBS, 500 ul / poço. </li><li> Incubar as células em 400 ul / poço de tampão de bloqueio (1X PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA), 10% de soro de burro normal, e 0,3% de Triton X-100) durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Incubar em anticorpo primário em fabricantes concentração recomendada em 400 ul / poço de tampão de bloqueio durante 3 horas a temperatur ambientee ou durante a noite a 4 ° C. Quando se utiliza um anticorpo primário directamente conjugado com um fluorocromo, incubar as amostras no escuro. </li><li> Lave as células três vezes em 500 ul / poço de 1X PBS contendo BSA a 0,1% durante 5 min cada lavagem. Quando se utiliza um anticorpo primário diretamente conjugado a um fluorocromo, prossiga diretamente para o passo 2.12. </li><li> Incubar as células em anticorpo secundário na concentração recomendada pelo fabricante em 400 ul / poço de 1X PBS contendo 1% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lave as células três vezes em 500 ul / poço de 1X PBS contendo BSA a 0,1% durante 5 min cada lavagem. </li><li> Se se desejar, os núcleos com DAPI contracoloração solução. </li><li> Lavar as células em água deionizada e montar lamelas de bruços sobre um slide usando a mídia de montagem. </li></ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

R &amp; D Systems, Inc. é uma empresa pública com fins lucrativos. Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela R &amp; D Systems, Inc.

Os métodos anteriores para a indução de EMT têm geralmente usado estimulação de TGF-β ou modificação genética. Embora o TGF-β sozinho demonstrou induzir EMT em alguns tipos de células, que já foi demonstrado que TGF-β é necessário para EMT, mas não é suficiente em todos os tipos de células de 6,14. Usando modificação genética para a indução de EMT é demorado e trabalhoso. O método descrito aqui utiliza uma combinação de factores, incluindo, anti-humano de E-caderina, sFRP-1 anti-humano, Dkk-1 anti-humano, recombinante humana de Wnt-5a, e recombinante humana TGF-β1 para induzir de forma fiável EMT. Esta combinação de factores é concebido para bloquear a adesão de E-caderina-base, um passo crítico para a indução de EMT 4, e melhorar a sinalização de Wnt, adicionando a proteína Wnt-5a, bem como a utilização de anticorpos de bloqueio para os inibidores de Wnt, sFRP-1 e Dkk -1. Wnt e de sinalização de TGF-β foram mostrados para agir em um loop autócrino para induzir e manter a estatística de células mesenquimaise 6. Este método evita a indução da manipulação genética e é mais eficaz do que a utilização de TGF-β sozinho. Importante, que é capaz de observar a indução de EMT em tipos de células, incluindo MCF7 e PANC-1 de células, que tenham sido previamente demonstrado que não respondem exclusivamente a estimulação de TGF-β (Figura 5) 14. As células tratadas com o EMT Induzir Mídia Suplemento show de morfologia fusiforme menos compacto e maior (Figura 1). Além disso, há uma diminuição da superfície de E-caderina expressão concomitante com um aumento na expressão de fibronectina, que são características de EMT (Figuras 2 e 3). Mesenquimais marcadores adicionais tais como vimentina e caracol também são regulados positivamente em células induzidas EMT, em comparação com os controlos não induzidos (Figura 4). Aumento habilidades de migração e invasão são as principais características funcionais das células mesenquimais. Em in vitro </em&gt; Migração e invasão ensaios, as células tratadas com o Suplemento EMT Indução de mídia demonstraram um aumento significativo da capacidade de migrar e invadir (Figura 6). Este método simples para a indução de EMT é útil para o estudo da sinalização EMT como demonstrado utilizando os dados de expressão de anticorpo de matriz mostradas na Figura 7. Diferentes tipos de células podem ser comparadas e pré-indução de pós-EMT para obter assinaturas de expressão mais comuns associados com EMT, tais como o aumento da CREB fosforilado e ERK1 / 2 observada em ambos MCF7 e de células induzida por EMT A549. S133 fosforilação de CREB estimula a ligação ao ADN e tem sido mostrado que actua a jusante de TGF-induzida por β1 EMT 15. ERK1 / 2 fosforilação também foi mostrado que actua a jusante de TGF-induzida por β1 EMT 16. Diferenças nas vias de sinalização entre os tipos de células também pode ser elucidada como pode ser visto com o aumento na GSK-3β fosforilação em células A549 contra p70S6K fosforilação em MCF7. Fosforilação GSK-3β na serina 9 diminui a função, e GSK-3β foi mostrado para inibir o factor de transcrição pró-EMT, caracol 17. Em contraste, p70S6K induz actividade de Snail e a sua fosforilação está associada com a activação de esta proteína de 18. No geral, a indução simples e confiável de EMT, particularmente em células previamente apresentados não responder unicamente para TGF-β, é útil para a compreensão da biologia da EMT, identificar assinaturas de expressão comuns para o uso como marcadores prognósticos e desenvolvimento e avaliação de novas terapias para o câncer e doença fibrótica.

Epitelial para mesenquimal (EMT) é o processo pelo qual uma célula epitelial polarizada sofre uma variedade de alterações que resultam em, uma célula mesenquimal altamente móveis do tipo fibroblasto. Este processo ocorre, em parte, através de mudanças de expressão do gene e a degradação das junções aderentes, o que resulta num aumento da capacidade de migrar e invadem. Fisiologicamente, EMT desempenha um papel importante durante o desenvolvimento embrionário e cicatrização de feridas. Perda de controle adequado sobre EMT pode levar a fibrose e metástases de carcinomas 1,2. A redução de E-caderina sobre a superfície de células epiteliais é um passo crítico para a progressão de uma célula através de EMT 3,4. A E-caderina é uma proteína transmembranar com uma única passagem que interage directamente com as proteínas da caderina nas células adjacentes. Em adição ao seu papel na adesão celular, a sinalização de E-caderina influências celular através de interacções entre a cauda citoplasmática de E-caderina umda variedade de proteínas reguladoras, nomeadamente β-catenina. β-catenina desempenha um papel importante na estabilização de junções aderentes. Durante canónica sinalização Wnt, β-catenina é libertado a partir de E-caderina e translocado para o núcleo, onde actua como um factor de transcrição a jusante na via de Wnt 3,4,5. No núcleo, β-catenina foi mostrada para aumentar a transcrição de diversos factores relacionados com o EMT, incluindo torção, Slug, fibronectina, e uma variedade de metaloproteinases de matriz de 3,6. Além Wnts, a sinalização de TGF-β tem mostrado desempenhar um papel significativo na indução de EMT tanto durante o desenvolvimento normal e em estados de doença 7,8,9. TGF-β está envolvida na EMT que ocorre durante a formação da boca e no coração em desenvolvimento 10. Também foi implicada na fibrose e na progressão do cancro da metástase 7. O procedimento descrito aqui provides indução consistente de EMT em uma variedade de tipos de células, sem a necessidade de manipulação genética. Este processo utiliza uma mistura de E-caderina, sFRP-1, e Dkk-1 e anticorpos bloqueadores de Wnt-5a e proteínas recombinantes de TGF-β1. Este coquetel é projetado para bloquear E-caderina baseada adesão ao realçar Wnt e TGF-β sinalização. A capacidade para a indução de EMT robusta é fundamental para a compreensão da biologia do processo e como manipulá-lo para fins terapêuticos. Marcadores comuns atuais da EMT, E-caderina (downregulated em EMT) e vimentina (regulada em EMT), podem ser encontrados co-expressos em câncer e assim não fornecem os melhores marcadores de diagnóstico de potenciais células metastáticas 12. Mais importante, a análise de uma variedade de tipos de células que tenham sido submetidos a EMT é útil para o desenvolvimento de assinaturas de expressão de genes comuns que podem ser utilizados para fins de diagnóstico em cancro e fibrose 11. Além disso, estudos recentes demonstraram que a LMT pode desempenhar um papel na formação de células estaminais de cancro, o que sugere que as células que sofreram EMT pode ser útil para o rastreio de fármacos para identificar compostos que pode ter como alvo estas células 13.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

Epitelial para mesenquimal (EMT) é essencial para a morfogénese adequada durante o desenvolvimento. A desregulação do processo tem sido implicada como um evento chave na fibrose e a progressão de carcinomas para um estado metastático. Compreender os processos que estão na base EMT é fundamental para o diagnóstico precoce e controle clínico dessas doenças. Indução de confiança de EMT in vitro é uma ferramenta útil para a descoberta de medicamentos, bem como para identificar as assinaturas comuns de expressão gênica para fins de diagnóstico. Aqui demonstramos um método simples para a indução de EMT em uma variedade de tipos de células. Os métodos para a análise de células de pré-e pós-indução por EMT imunocitoquímica também estão incluídos. Além disso, demonstram a eficácia deste método, através da análise de matriz baseada em anticorpos e ensaios de migração / invasão.

. EMT induzem as condições de cultura aqui descritas proporcionam um método fiável para a indução de EMT em uma variedade de tipos de células As Figuras 1 e 2 mostram a morfologia da e os níveis de expressão do marcador de quatro diferentes linhas de células humanas: células de glioblastoma T98G, HT29, células de adenocarcinoma de cólon , células de carcinoma do pulmão A549 e MCF10A células epiteliais mamárias. As células que foram tratados com o suplemento de EMT Induzir Meios mudou de uma morfologia clássica epitelial (Figuras 1A - 1D) para um mesenquimal, morfologia fusiforme (figuras 1E - 1H). Células induzidas EMT apareceu menos densamente embalado em colônias apertados em comparação com células não induzidas. Amostras não induzidas MCF10A contidas aglomerados hermeticamente embalados cercadas por células mais frouxamente embalados. Estes agrupamentos foram hermeticamente embalados E-caderina positivo (Figura 2D) e desapareceu após o tratamento com a EMT Induzir Mídia Supplemento (Figura 2H). EMT, também foi avaliado pela regulação baixa de marcadores epiteliais e aumento da expressão de marcadores mesenquimais. A regulação negativa da expressão de E-caderina é tipicamente observado após a indução de EMT em diferentes tipos de células de 3,4 a Figura 2 mostra a expressão da superfície de E-caderina na maioria das células não tratadas (Figuras 2A - 2D; vermelho). Em comparação com a sua ausência depois indução EMT (Figuras 2E - 2H, vermelho). Uma linha celular, T98G, foi encontrado para ter um baixíssimo nível basal de E-caderina antes da indução EMT, o que impedia a sua análise. Upregulation do marcador mesenquimal, fibronectina, também foi visível após a indução com o Suplemento EMT Indução de mídia (Figuras 2A - 2D contra Figuras 2E - 2H; verde). Os níveis de E-caderina e Fibronectina expressão visto por imunocitoquímicaForam ainda confirmada através de Western blotting de lisados ​​de células totais (Figura 3). O Western blot confirmou a regulação negativa da E-caderina e a regulação positiva da expressão de fibronectina vista por imunocitoquímica. As bandas foram quantificadas utilizando densitometria e normalizados para GAPDH para determinar a mudança vezes em relação após a indução EMT. Níveis de E-caderina foi reduzida de 6,4 e 3,4 vezes na A549 e células MCF10A, respectivamente. Níveis de fibronectina foram aumentadas de 4,6, 4,1, e 2,3 vezes na T98G, A549 e células MCF10A, respectivamente. Embora o Western blot não mostram redução significativa dos níveis da proteína E-caderina nas células HT29 de indução pós-EMT, os resultados imunocitoquímica demonstram uma redução na expressão de superfície de E-caderina (Figura 2B contra 2F), que é capaz de ser distinguida em Western blotting de lisados ​​de células totais. Para melhor avaliar o estado EMT, conhecido marcador adicionals para EMT foram analisadas pré e pós-indução EMT. Consistente com os resultados anteriores, a E-caderina foi regulada negativamente em todas as linhas celulares examinadas, o que indica que foi induzida EMT. Além disso, os marcadores de mesenquimais, vimentina e caracol, foram regulados positivamente em A549, T98G e MCF10A células após o tratamento com EMT Induzir Meios suplemento (Figura 4). A linha de células HT29 não mostraram expressão destes marcadores mesenquimais com ou sem indução de EMT (dados não mostrados), o que pode indicar que as células utilizam vias alternativas para a indução de EMT. Embora o TGF-β é suficiente para induzir a EMT em certos contextos célula 7,8,9, outros tipos de células não respondem exclusivamente para a adição de TGF-β 14. MCF-7 células de câncer de mama humano e PANC-1 células de carcinoma do pâncreas humanos são ambos relataram não responder a sinalização sozinho 14 TGF-β. Para determinar se ambas as linhas podem sofrer EMT em VITRo, as células foram cultivadas na presença de suplemento EMT Induzir Media. As células foram estimuladas com proteína recombinante de TGF-β1 sozinho, com a concentração no interior do Suplemento EMT Induzir Media. Estas células mantiveram a sua morfologia epitelial, que consiste em colónias de células embaladas apertadamente (dados não mostrados) e os níveis de E-caderina de superfície foram semelhantes aos observados em células de controlo (Figuras 5C e 5D contra Figuras 5A e 5B). Em contraste, as células estimuladas com o Suplemento EMT Indução de mídia mostraram uma diminuição drástica nos níveis de E-caderina superfície (Figuras 5E e 5F). Estas células também obtida uma morfologia mais mesenquimais, as células tornaram-se menos compacto e mais fusiformes (dados não mostrados). Estes resultados demonstram que o método de indução de EMT aqui descrita é capaz de promover a morfologia EMT e marcadores mudanças de expressão em células normalmente resistentes ao TGF-β-iEMT nduced. Além de mudanças na expressão do marcador, outra marca registrada de células mesenquimais é a sua capacidade de migrar e invadir. A migração e invasão de células de cultura com ou sem suplemento de EMT Induzir Os meios foram analisados ​​utilizando o bem BME 96 invasão celular Ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços (50000 células / poço) contendo inserções de filtro com 8,0 mM poros. Após 48 horas, a migração foi avaliada por calceína AM de coloração de células que migraram através do filtro. Cada amostra foi testada em triplicado duas vezes com resultados semelhantes. Os resultados representativos de uma experiência são apresentados na Figura 6A. Aumentos estatisticamente significativos (P-valor &lt;0,003) na migração celular foram vistos com tanto A549 e PANC-1 células após indução EMT. Para avaliar a capacidade destas células para invadir (ou seja, migram através da matriz extracelular), o mesmo ensaio foirealizada com um filtro revestido com extracto de membrana basal. As células induzidas por EMT mostrou um (valor P &lt;0,001) aumento estatisticamente significativo na capacidade de invasão em comparação com células não tratadas, como visto na Figura 6B. A indução robusta de EMT é útil para a análise de alterações de expressão de genes e de sinalização que ocorrem nestas células. A análise de matriz à base de anticorpo utilizando os lisados ​​de células tratadas e não tratadas, tanto é um método para analisar os níveis de uma variedade de moléculas de expressão numa única amostra. Como exemplo, foram analisados ​​os níveis de fosforilados membros da família MAPK em lisados ​​de un-induzido e EMT-induzida MCF7 e células A549 utilizando o Kit Matriz Proteoma Humano Profiler Phospho-MAPK. A matriz foi executado duas vezes a partir de tratamentos independentes EMT-indução, com resultados semelhantes. Figura 7 mostra dados representativos a partir de uma matriz. Ambos os tipos de células exibiram aumento da fosforilação de CREB (S133), a ERK1 (T2<html> 02/Y204) e ERK2 (T185/Y187) em células induzidas por EMT comparação com os controlos. Foram observadas diferenças nos acontecimentos de sinalização entre os dois tipos de células, bem. As células A549 apresentaram um aumento na GSK-3 β (S9) de fosforilação, enquanto que as células MCF-7 mostraram um aumento p70S6K (T421/S424) fosforilação. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 1. Mesenquimais morfologia indução após estimulação com o Suplemento EMT Induzir Mídia (A - D). Morfologia epitelial nos quatro tipos de células indicado seguinte cultura por 5 dias em meio de cultura padrão sem suplemento EMT Indução de mídia (E - H). Morfologia mesenquimais no quatro tipos de células indicado cultivados com suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. nt &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 2. Regulação negativa da expressão de marcadores epiteliais e supra-regulação de expressão do marcador mesenquimais em células induzidas por EMT. Células foram coradas por imuno-fluorescência para detectar a expressão do marcador epitelial, a E-caderina (vermelho), e o marcador mesenquimal, fibronectina (verde). (A - D) células cultivadas de controle sem suplemento EMT Indução de mídia para 5 dias (E - H.) Células cultivadas com o Suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. Todas as células são contrastado com DAPI (azul). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. A confirmação da expressão do marcador epitelial e mesenquimal com um western blot<html> . alysis Western blot de lisados ​​de células totais dos quatro tipos de células indicado, tratou-se com (EMT) ou sem (-) o suplemento de EMT Induzir meios durante 5 dias. Bandas para a E-caderina, fibronectina, e o controlo de GAPDH carregamento são como indicado no lado esquerdo. O marcador de tamanho é tal como indicado no lado direito. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. A sobre-regulação dos marcadores mesenquimais, vimentina e Snail em células induzidas por EMT. Células foram coradas por imuno-fluorescência multicolor para detectar a expressão do marcador epitelial, a E-caderina (cinzento), e os marcadores de mesenquimais, vimentina (verde) e caracol (vermelho) células cultivadas de controle sem o suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. - (C A). (D - F) Células cultivadas com o Suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. lways &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 5. Indução de EMT em células que não respondem TGF-β1. (A e B) Células cultivadas com meio sozinho durante 5 dias. (C e D) Células cultivadas em meio contendo 10 ng / ml de TGF-β1 durante 5 dias. (E e F) células cultivadas em EMT Induzir Mídia Suplemento 5 dias. Todas as células são coradas para a expressão da caderina-E (vermelho) e contrastado com DAPI (azul). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Células induzidas por EMT têm aumentado as capacidades de migração e invasão. A. número de células que migraram através de um filtro de poros 8 mM após incubação de 48 horas. Número médio de B.As células que eram capazes de invadir através de um filtro de poro de 8 um revestidas com extracto de membrana basal, após incubação durante 48 horas. As barras de erro indicam o desvio padrão de 3 poços. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Matriz de análise de expressão baseado no anticorpo Figura 7. De indução EMT. Lisados ​​de A549 (A e C) e MCF7 (B e D), as células cultivadas com ou sem EMT Induzir Mídia Supplement foram utilizados para análise matriz usando o Kit Matriz Proteoma Humano Profiler Phospho-MAPK. Spots em destaque na A e B foram então quantificadas utilizando densitometria. Comparações de induzidas un lisados ​​induzidas a EMT são mostrados nos gráficos de barras correspondentes abaixo (C e D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura &lt;</a>/ A&gt;.

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Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Um método simples é descrito para a indução de células epiteliais para mesenquimal (EMT) em uma variedade de tipos de células. Métodos de análise de células em EMT estados por imunocitoquímica estão incluídos.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

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Research

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Biology

35.5K visualizações.  R&D Systems, Inc..  Um método simples é descrito para a indução de células epiteliais para mesenquimal (EMT) em uma variedade de tipos de células. Métodos de análise de células em EMT estados por imunocitoquímica estão incluídos. 

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Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Claro / escuro Teste de transição para Ratos

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Manipulando o Murino lacrimais Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...