Derivatização de Cristais de Proteína com I3C usando Triagem de Matriz Microseada Aleatória

Este é um protocolo de cristalização projetado para otimizar o crescimento de um cristal proteico ao mesmo tempo em que deriva a proteína com uma molécula de eliminação para determinar a estrutura de uma proteína por cristalografia de raios-X. Para determinar a estrutura cristalina de raios-X de uma proteína completamente nova, as condições de cristalização são otimizadas para produzir cristais de qualidade. No caso de uma proteína completamente nova, átomos pesados precisam ser introduzidos no cristal para produzir um cristal derivado.

Os dados de difração de raios-X são coletados do cristal derivatizado e devem ser computacionalmente resolvidos para produzir uma estrutura de cristal de raios-X. Cristalização e derivitação são processos trabalhosos. Para enfrentar esses gargalos, elaboramos um procedimento de triagem otimizado que simultaneamente alcança esses dois objetivos.

Este protocolo usa uma técnica previamente desenvolvida conhecida como triagem de matriz microseada aleatória. Cristais ou precipitados cristalinos são esmagados em microseeds que podem ser usados para iniciar o crescimento de cristais em condições completamente independentes. Ao mesmo tempo, introduzimos uma molécula de eliminação chamada I3C na condição de cristalização.

Esta molécula fornece um grande sinal anômroo que permite que a estrutura seja resolvida por uma única discussão anômroa de comprimento de onda. Para usuários não familiarizados com o dimensionamento experimental de estruturas de cristal, apresentamos um pipeline de software fácil de usar para automatizar parcialmente a solução de estrutura adaptando-a para usar o sinal anômo do I3C. O primeiro passo é criar um estoque I3C.

Meça 120 miligramas de I3C em um tubo de microcentrífuga. Adicione 200 microliters de dois hidróxido de lítio molar ao tubo de microcentrífuga. O aquecimento do tubo a 40 a 60 graus e o vórtice podem ser usados para incentivar a dissolução.

O único estoque molar da solução I3C de lítio deve ser marrom. Dois métodos podem ser usados para introduzir o I3C no estoque de proteínas. O lítio I3C pode ser adicionado diretamente ao estoque de proteínas.

3,75 microlitres a 30 microliters de I3C podem ser adicionados a 150 microliters de proteína para dar uma concentração entre cinco e 14 mililamores. Algumas proteínas podem precipitar-se após o contato com altas concentrações de I3C. Nestes casos, o lítio I3C pode ser adicionado a um tampão de diluição proteica que é tampão correspondendo a proteína amostral a uma concentração final entre 10 a 80 mililitros.

Adicione 150 microliters do tampão de diluição proteica a 150 microliters de amostra de proteína. Uma sonda de vidro para esmagar cristais é feita de uma pipeta Pasteur de vidro. Com um bico de Bunsen na chama azul, aqueça a pipeta Pasteur em direção ao meio.

Usando um par de pinças, puxe as extremidades da pipeta Pasteur para fora em um diâmetro fino de menos de 0,3 milímetros. Segure esse segmento na chama para separar a pipeta neste ponto e contornar a extremidade da pipeta para finalizar a sonda de vidro. Este é um exemplo de como a pipeta de vidro deve parecer.

Esmagamentos de cristal também podem ser encomendados de fornecedores de terceiros como uma alternativa para fazer o seu próprio estoque de microseado A é gerado esmagando cristais de proteína ou precipitados cristalinos. Coloque cinco tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL no gelo. Sob um microscópio leve, selecione os melhores cristais de morfologia ou precipitados cristalinos que podem ser sacrificados.

Para 96 bandejas de cristalização bem abra o poço cortando a fita de vedação de plástico. Para pendurar bandejas de gota, o deslizamento da tampa pode ser removido usando pinças e invertido em uma superfície plana. Transfira 70 microliters de solução de reservatório para um dos tubos de microcentrifuuagem e esfrie no gelo.

Para os tubos restantes, transfira 90 microliters de solução de reservatório para ele e retorne ao gelo para esfriar. Se houver volume insuficiente de cristalização, o reservatório de cristalização pode ser feito misturando os reagentes apropriados e pode ser usado em seu lugar. Agitar os cristais na gota de cristalização usando a sonda de vidro esmagá-lo completamente.

O progresso pode ser monitorado sob o microscópio até que nenhum cristalismo ou material cristalino seja visível. Transfira todo o líquido da gota para o tubo de microcentrifuuge contendo 70 microliters de solução de reservatório. Misture por pipetting para cima e para baixo.

Transfira de dois a três microliters de mistura de volta para o poço e enxágue o poço pipetando para cima e para baixo. Transfira a mistura de volta para o tubo de microcentrifuagem. Este passo de enxágüe deve ser repetido mais uma vez.

O tubo de microcentrifuge deve ser mantido frio a partir deste ponto para a frente para evitar o derretimento das microseeds. Vórtice o tubo a velocidade máxima a quatro graus por cerca de três minutos esfriando o tubo no gelo regularmente para evitar superaquecimento. fazer uma em cada 10 diluições seriais do estoque de sementes transferindo sequencialmente 10 microliters entre as soluções de reservatório refrigerado.

Entre diluições de estoque de sementes, o tubo deve ser vórtice. Os estoques de sementes que não serão usados imediatamente, devem ser armazenados em um congelador ultra frio de menos 80 graus. Uma tela de matriz microseada bem aleatória de 96 bem aleatórias pode ser configurada usando um robô de distribuição de líquidos.

Coloque o estoque de sementes, solução de estoque de proteína suplementada com I3C e tela de cristalização no robô. Usando o robô transferir 75 microliters da tela de cristalização para a bandeja do poço 96. Adicione um microliter à queda de cristalização e 74 microliters ao reservatório.

Transfira um microliter de proteína suplementado com I3C para a queda de cristalização. Transfira 0,1 microliters de sementes para a queda de cristalização. Sele a placa usando fita de vedação.

As telas de gota suspensas podem ser configuradas em 24 bandejas de cristalização de gota suspensas. Unte as bordas dos poços de queda pendurados. Transfira 500 microliters de solução de cristalização para o reservatório.

Perto do centro de um deslizamento de tampa de vidro coloque uma gota de uma única microliter de solução de cristalização. Para esta queda, adicione um microlitra de proteína suplementada com lítio I3C e 0,1 microliters de estoque de sementes. Inverta o slide da tampa e sele bem a cristalização empurrando a tampa deslizar para dentro da graxa.

As bandejas de gota suspensas e vedação são incubadas a uma temperatura constante para permitir que os cristais se formem. Eles devem ser regularmente inspecionados sob um microscópio para crescimento de cristais. Após a obtenção de dados de difração, integrados e dimensionados conforme explicado no protocolo escrito acompanhado, o pipeline automatizado de determinação da estrutura cristalina Auto-Rickshaw pode ser usado para resolver o problema de fase e modelar a proteína.

Na página de aterrissagem auto-riquixá, clique no botão prosseguir. Digite seu e-mail institucional no formulário web Auto-Rickshaw e clique em prosseguir com a execução do Auto-Rickshaw. Para proteínas sem um modelo de moto de emologia execute o protocolo SAD de Auto-Rickshaw em modo avançado.

Digite os parâmetros necessários. Selecione proteína como o tipo de molécula. Digite o comprimento de onda de coleta de dados em angstroms.

Assim como eu como elemento de subestrutura para indicar átomos de iodo foram usados. Selecione o tipo de subestrutura I3C para indicar que I3C foi a molécula de eliminação. Selecione sub_direct como o método de determinação da subestrutura.

Selecione três como o número de subestruturas esperadas por monômero. Digite um como o limite de reserva da pesquisa de subestrutura. Isso permite que o Auto-Rickshaw determine automaticamente um corte de resolução adequado.

Digite o número de resíduos em um único monômero, grupo espacial do conjunto de dados e número de moléculas na unidade assimétrica com base no coeficiente matthews. Selecione o nível de disseminação adequado dos dados de raio-x que se adaptem às suas necessidades. Insira os dados anômalos como um arquivo de conjunto vazio.

Insira sua sequência de proteínas como um arquivo SEQ, PIR ou TXT. Digite seu endereço de e-mail institucional. Os resultados são entregues a você através de um link web enviado para o endereço de e-mail fornecido.

Se o Auto-Rickshaw não resolver a estrutura usando sua subestrutura determinada validando a subestrutura poderia ajudar na solução de problemas da estrutura. Baixe a lista de sites de átomos pesados da página de resultados do Auto-Rickshaw. É um hiperlink chamado locais átomos pesados.

Isso irá baixar um arquivo de texto com os sites de átomos pesados. Altere a extensão de arquivo do arquivo de txt para pdb. Abra o arquivo pdb em Coot.

Ligue a simetria para ver todos os átomos pesados das unidades assimétricas vizinhas. Meça as distâncias entre os átomos pesados, inclusive através de unidades assimétricas. I3C aparecerá como um triângulo equilátero com um comprimento lateral de seis angstroms.

A presença de um triângulo com essas dimensões indica que as colocações desses átomos pesados estão corretas. Se a subestrutura de execução auto-riquixá estiver incorreta, outras configurações de Auto-Rickshaw podem ser testadas conforme discutido no protocolo escrito. O método I3C RMMS foi testado em duas proteínas, a lisesoz branca de ovo de galinha usando a tela HT da Hampton Research e o domínio da proteína de lise orf11 da bacteriófago P68.

Telas completas foram configuradas para cada proteína correspondente à tela de controle sem I3C ou microseed, tela com microseado adicionado, tela com I3C, e finalmente a tela com I3C e microseed. Adicionar I3C a uma tela de cristal não parece aumentar o número de acertos de cristalização. Com a lise de ovo de galinha, o número de condições caiu de 31 para 26.

Com o domínio Orf11, uma única condição de acerto foi encontrada na tela de controle. Adicionar I3C à tela também deu um único hit nas mesmas condições. A adição de microseado ao poço resultou em um aumento significativo no número de condições de impacto, resultando em um aumento de 2,1 e 6 vezes para a lise branca de ovo de galinha e o domínio Orf11, respectivamente.

Este resultado é consistente com outros estudos que testam a RMMS. Mais importante, adicionar I3C e microseed a uma tela também aumentou o número de condições de impacto em relação à tela de controle demonstrando um aumento de 2,3 e sete vezes para a lise branca de ovo de galinha e o domínio Orf11, respectivamente. Isso demonstra que o método I3C RMMS pode produzir eficientemente novas condições para cristais derivatizados.

Cristais dessas condições poderiam ser colhidos e usados para resolver a estrutura cristalina. Tanto a estrutura do domínio de lysozyme orf11 branco de galinha poderia ser resolvida com o esfing SAD no pipeline Auto-Rickshaw, usando o sinal anômeo do I3C demonstrando a derivitação bem sucedida pela tela I3C RMMS. Apresentamos um protocolo simples e eficiente para produzir cristais de alta qualidade derivados com a molécula de corte I3C.

Minimiza o número de telas e etapas de manuseio cristalino, e, portanto, é de particular interesse para biólogos estruturais que estudam novas proteínas. Recomendamos fortemente otimizar o tamanho do cristal testando diferentes diluições de estoque de sementes que foram feitas durante a preparação do estoque de sementes. E esta etapa é concluída após as telas iniciais terem sido feitas.

O I3C está amplamente disponível e é barato comprar e, portanto, acreditamos que este método está ao alcance da maioria dos laboratórios de biologia estrutural.