这是一个结晶协议，旨在优化蛋白质晶体的生长，同时通过相位分子推导蛋白质，通过X射线晶体学确定蛋白质的结构。为了确定一种完全新颖的蛋白质的X射线晶体结构，优化了结晶条件，以产生高质量的晶体。在完全新颖的蛋白质的情况下，重原子需要被引入晶体中，以产生衍生晶体。
X射线衍射数据是从衍生晶体中收集的，必须计算解决才能产生X射线晶体结构。结晶和推导都是费力的过程。为了解决这些瓶颈，我们设计了一个优化的筛选程序，同时实现这两个目标。
该协议使用以前开发的技术称为随机微种子矩阵筛选。晶体或晶体沉淀物被粉碎成微种子，可用于在完全独立的条件下开始晶体生长。同时，我们在结晶条件下引入一种称为 I3C 的相位分子。
该分子提供大异常信号，允许通过单波长异常讨论阶段解决结构。对于不熟悉晶体结构实验尺寸的用户，我们提出了一个用户友好的软件管道，用于部分自动化结构解决方案，以定制它，以使用来自 I3C 的异常信号。第一步是创建 I3C 股票。
将120毫克的 I3C 测量到微离心管中。在微离心管中加入200微升两个氢氧化锂。将管子加热40至60度，涡旋可用于鼓励溶解。
锂 I3C 溶液的摩尔库存应该是棕色的。可以使用两种方法将 I3C 引入蛋白质存量。锂 I3C 可以直接添加到蛋白质库存中。
3.75 微升至 30 微升 I3C 可添加到 150 微升蛋白质中，使浓度介于 5 至 14 毫摩尔之间。某些蛋白质在接触高浓度的 I3C 时会沉淀。在这些情况下，锂 I3C 可以添加到蛋白质稀释缓冲液中，该缓冲液将样品蛋白与最终浓度匹配为 10 至 80 毫摩尔。
在150微升蛋白质样品中加入150微升蛋白质稀释缓冲液。玻璃探头粉碎晶体是由玻璃巴斯德移液器。蓝色火焰上有一个邦森燃烧器，将巴斯德移液器加热到中间。
使用一对钳子，将巴斯德移液器的末端拉出，其直径小于 0.3 毫米。此时，握住火焰中的该段以分离移液器，并围绕移液器的末端完成玻璃探头。这是玻璃移液器的外观示例。
晶体粉碎也可以从第三方供应商订购，作为制造自己的微型种子库存的替代方案，通过粉碎蛋白质晶体或晶体沉淀物产生。将五根1.5 mL微离心管放在冰上。在光学显微镜下，选择可以牺牲的最佳形态晶体或晶体沉淀物。
对于 96 个井结晶托盘，通过切割塑料密封胶带打开井。对于悬挂拖放盘，可以使用钳子拆下盖滑，并倒置到平坦的表面上。将 70 微升储液转移到其中一个微离心管中，并在冰上冷却。
对于剩余的管子，将90微升的储层溶液转移到其中，然后返回冰面冷却。如果储液罐体积不足，可以通过混合适当的试剂进行结晶储液，并可代替使用。使用玻璃探针将结晶滴中的晶体彻底压碎。
在显微镜下可以监测进度，直到看不到晶体或晶体材料。将所有液体从落液转移到含有 70 微升储液液的微离心管中。通过上下移液混合。
将两到三微升的混合物移回井中，然后上下移液冲洗井。将混合物转移回微离心管。此冲洗步骤应再次重复。
微离心管应保持冷，从这一点向前，以避免融化的微种子。以四度的最高速度旋转管子，约三分钟，定期在冰上冷却管子，以防止过热。在冷却储层溶液之间按顺序传输 10 微升，对种子库存进行 10 次连续稀释。
种子库存稀释之间，管应涡流。不会立即使用的种子库存，应存放在零下80度的超冷冰柜中。可以使用液体点胶机器人设置 96 井随机微种子矩阵屏幕。
将种子库、蛋白质储存溶液与 I3C 和结晶屏一起放在机器人中。使用机器人将 75 微升从结晶屏幕转移到 96 井盘。在结晶滴中加入一微升，在储液罐中加入 74 微升。
将一微升蛋白质与 I3C 补充转移到结晶滴中。将0.1微升的种子存量转移到结晶下降。使用密封胶带密封板。
悬挂滴网可设置在 24 个井挂滴结晶托盘中。润滑悬挂落井的边缘。将 500 微升结晶溶液转移到储液罐中。
在玻璃盖幻灯片的中心附近放置一滴微升结晶溶液。在此下降，添加一微升蛋白质辅以锂 I3C 和 0.1 微升的种子库存。将盖滑滑入润滑脂，反转盖滑轨并密封结晶井。
悬挂滴和密封滴盘在恒定温度下孵育，使晶体形成。应定期在显微镜下检查晶体生长情况。在获得衍射数据后，如随同的书面协议所述，可采用自动-里克肖自动晶体结构测定管道解决相位问题并建模蛋白质。
在自动里克肖着陆页，单击"继续"按钮。在自动里克肖 Web 表单中输入您的机构电子邮件，然后单击继续运行自动里克肖。对于没有同源本模板的蛋白质，在高级模式下运行自动里克肖的S一S SAD协议。
输入所需的参数。选择蛋白质作为分子类型。输入以焦虑的表示输入数据收集波长。
所以像我作为子结构元素来表示碘原子被使用。选择 I3C 子结构类型以指示 I3C 是相位分子。选择sub_direct作为子结构确定方法。
选择三个作为每个单体的预期子结构数。输入一个作为子结构搜索的预留截止。这允许自动里克肖自动确定合适的分辨率截止。
输入基于马修斯系数的单体、数据集空间组中的残渣数和非对称单元中的分子数。选择适合您需求的 X 射线数据的适当传播级别。将异常数据输入为空集文件。
输入您的蛋白质序列作为SEQ，PIR或TXT文件。输入您的机构电子邮件地址。结果通过发送到提供的电子邮件地址的 Web 链接发送给您。
如果 Auto-Rickshaw 未能使用其确定的子结构验证子结构来解决结构问题，则有助于对结构解决方案进行故障排除。从自动里克肖结果页面下载重原子网站列表。它是一个称为重原子位的超链接。
这将下载一个文本文件与重原子网站。将文件的文件扩展名从 txt 更改为 pdb。打开库特中的 pdb 文件。
打开对称性以查看来自相邻非对称单位的所有重原子。测量重原子之间的距离，包括非对称单位之间的距离。I3C 将显示为等边三角形，侧长为 6 个焦虑。
具有这些尺寸的三角形的存在表示这些重原子的位置是正确的。如果自动里克肖运行子结构不正确，可以测试其他自动里克肖设置，如书面协议中讨论。I3C RMMS 方法在两种蛋白质上进行了测试，即使用汉普顿研究的 HT 屏幕和来自噬菌体 P68 的 Orf11 lysin 蛋白质领域对母鸡蛋清lysozyme进行测试。
为与控制屏幕对应的每个蛋白质设置了全屏，无需 I3C 或微种子，屏幕添加微种子，屏幕与 I3C，最后屏幕与 I3C 和微种子。将 I3C 添加到水晶屏幕似乎不会增加结晶命中次数。与母鸡蛋清的利索酶，条件从31个下降到26。
使用 Orf11 域，在控制屏幕中发现单个命中条件。将 I3C 添加到屏幕也会在相同条件下进行一次点击。向井中添加微籽导致命中条件显著增加，导致母鸡蛋清酶和 Orf11 域分别增加了 2.1 倍和 6 倍。
此结果与其他测试 RMMS 的研究一致。最重要的是，将 I3C 和微籽添加到屏幕也增加了与控制屏幕相比的命中条件数，分别显示母鸡蛋清酶和 Orf11 域的 2.3 倍和 7 倍。这表明，I3C RMMS方法可以有效地为衍生晶体产生新的条件。
这些条件下的晶体可以收获并用于解决晶体结构问题。母鸡蛋清Lysozyme Orf11域的结构可以通过SS一级在自动里克肖管道上解决，使用来自C3C的异常信号，证明通过 I3C RMMS 屏幕成功派生。我们提出了一个简单而高效的协议，用于生产与相位分子 I3C 相化的高质量晶体。
它最大限度地减少了屏幕数量和晶体处理步骤，因此对研究新型蛋白质的结构生物学家特别感兴趣。我们强烈建议通过测试种子库存制备期间进行的不同种子库存稀释来优化晶体尺寸。此步骤在初始屏幕完成后完成。
I3C 是广泛可用的，它购买成本低廉，因此我们相信这种方法是大多数结构生物学实验室触手可及的。
