Este protocolo pode ser usado para identificar o papel de alvos moleculares individuais específicos na regulação da atividade eletrocorticgráfica durante diferentes estados de Vigilin. Entre os benefícios do uso do vírus associado ao adeno está a capacidade de atingir precisamente uma determinada região cerebral e um tipo de célula específica. Demonstrando o protocolo estará Julien Dufort-Gervais, um pesquisador associado da minha equipe.
Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do dedo do pé em um rato anestesiado de 12 semanas de idade, use um aparador de cabelo para raspar o cabelo da parte de trás das orelhas para a frente da cabeça entre os olhos. Adicione uma generosa gota de pomada oftálmica a cada olho para evitar a desidratação e use as barras de ouvido para fixar cuidadosamente a cabeça do mouse em um aparelho estereotaxico. Puxe suavemente a língua para fora da boca para evitar sufocamento.
Fixar o nariz do mouse no aparelho e usar 70% de etanol para esterilizar a pele exposta na cabeça. Segurando a pele com fórceps Graefe extra-finos, use tesouras de tecido para cortar a pele da base das orelhas até o nível dos olhos e colocar dois grampos cirúrgicos em cada lado da incisão para esticar a pele e expor o crânio. Evitando suturas cerebrais, use uma ponta de tesoura para arranhar a superfície do crânio para remover o periosteum e para criar listras sobrepostas em duas ou mais direções.
Use 70% de etanol para remover os fragmentos ósseos e desinfetar o crânio. Com uma cânula previamente preparada fixada ao braço estereotaxic, identifique a localização do bregma e lambda e observe as coordenadas estereotipadas de cada um. Use o braço estereotaxic e uma caneta para marcar a posição da cânula no crânio 1,5 milímetros lateral à direita para a linha média e 1,5 milímetros anterior à bregma.
Usando uma broca de 0,7 milímetros, fure cuidadosamente o crânio na posição marcada perpendicular à superfície do crânio e esteja alinhado com o eixo vertical e lave o crânio com uma ponta de algodão estéril embebida em uma solução de iodo povidona de 10% betadina, em seguida, retraia o êmbolo de uma seringa de 10 microliter por um microliter para carregar a cânula com uma bolha de ar microliter. Em seguida, misture a mistura de interesse AAV com tubulação lenta e adicione 1,7 microliters da mistura a uma placa de Petri estéril. Use esta seringa para carregar 1,5 microliters da solução na cânula e marque a posição da bolha de ar no tubo PE50 conectado.
Alinhe verticalmente a cânula com o orifício no crânio de modo que a cânula atinja a borda superior do osso e marque a coordenada Z da superfície do crânio. Abaixe lentamente a cânula até que a ponta atinja 1,5 milímetros abaixo da superfície do crânio e da camada cinco do córtex motor e inicie a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 0,025 microliter por minuto para entregar um microliter de AAV ao longo de 40 minutos. Use a bolha de ar no tubo para rastrear a injeção, fazendo quaisquer ajustes conforme necessário.
Quando todo o volume do vírus tiver sido entregue, deixe a cânula no lugar por cinco minutos para garantir uma difusão suficiente e evitar o backflow antes de levantar lentamente e cuidadosamente o braço estereotaxic para remover a cânula do córtex. Para implantação de eletrodos, use fórceps de Kelly retos para lentamente aparafusar um eletrodo eletrocorticográfico com um fio de ouro reto no eixo vertical do orifício em que o AAV foi injetado, deixando pelo menos 2,5 milímetros de parafuso fora do crânio para minimizar os danos à dura e ao córtex cerebral. Use uma caneta para marcar a posição do eletrodo de referência 2,6 milímetros lateral à direita para a linha média e 0,7 milímetros posterior para bregma e a posição do eletrodo eletrocardiográfico posterior a 1,5 milímetros lateral à direita até a linha média e 1,5 milímetros anterior à lambda e as posições de três parafusos de manutenção no hemisfério esquerdo sem coordenadas específicas, mas o mais distante possível um do outro e dos eletrodos eletrocorticográficos.
Use a broca para perfurar cuidadosamente o crânio perpendicular à superfície do crânio nas posições marcadas dos outros eletrodos e parafusos e lave o crânio perfurado com uma solução de iodo povidone de 10%. Bloqueie os orifícios com pequenos pedaços enrolados de limpeza de tarefa delicada antes de instalar os parafusos para evitar sangramento e contaminação e use fórceps de Kelly retos para inserir os parafusos nos furos de perfuração no mesmo ângulo que os furos foram perfurados. Coloque algumas pequenas gotas de cimento dental no centro do espaço tipo anel dentro dos parafusos e use fórceps graefe extra-finos para levantar a pele acima dos músculos do pescoço.
Usando o número cinco de Dumont, segure a extremidade curva de um eletrodo eletromiográfico e insira-o aproximadamente de um a dois milímetros nos músculos. Coloque o lado curvo e o ponto dobrável do eletrodo no cimento dentário e insira o segundo eletrodo eletromiográfico da mesma forma. Depois de cobrir os olhos do animal, aplique luz por três a cinco minutos para solidificar o cimento e use cimento dentário adicional para cobrir a base dos eletrodos eletrocorticográficos e os parafusos de âncora para formar um contorno em forma de coroa.
Depois de aplicar mais três a cinco minutos de luz, encha o centro da montagem com cimento acrílico e remova os grampos cirúrgicos. Use uma sutura de monofilamento absorvível sintético para fechar a pele na frente e atrás da montagem para que o crânio não seja exposto e use fórceps curvos para segurar o conector acima da montagem para alinhar cuidadosamente os fios dourados dos eletrodos com os pinos do conector, em seguida, soldar rapidamente cada extremidade eletrodo a um único pino de conector correspondente. Depois de remover o mouse da armação, cubra o espaço vazio entre o conector e a cabeça com o cimento acrílico.
E depois de pesar, coloque o rato em uma gaiola limpa com uma tampa não-misturada em uma almofada de calor. Duas semanas após a cirurgia, conecte os ratos aos cabos de gravação e, pelo menos uma semana depois, grave os sinais eletrocorticográficos e eletromiográficos por 24 horas ou mais. Uma infecção bem sucedida é confirmada pela coloração ha dos neurônios dentro do córtex motor ao redor do local da injeção, indicando a presença de cofilina S3D HA. A co-coloração com o marcador de neurônio excitatório CaMKII alfa indica cofilina clara S3D HA e co-expressão alfa CaMKII sob alta ampliação.
Os registros transformaram espectros relativos de energia para a vigília, sono de ondas lentas e sono paradoxal mostram diferenças específicas do estado na atividade espectral sob inativação de cofilina. A combinação de gravação eletrocorticgráfica e manipulação mediada por AAV de alvos moleculares precisos também é aplicável a múltiplas regiões cerebrais e a outros subcampos da neurociência, como pesquisas sobre epilepsia ou memória, além do sono.
