Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas capazes de respiração aeróbica. Sua disfunção é uma fonte bem conhecida de doença humana. As mitocôndrias de levedura de Baker contêm genoma circular codificando oito proteínas.
Neste vídeo, descrevemos o protocolo usado para avaliar a biossíntese proteica em mitocôndrias de leveduras por meio da rotulagem radioativa de produtos translacionais e posterior separação por eletroforese gel. O procedimento inclui várias etapas importantes. Leveduras de listras de culturas de estoque congelado em placas frescas com meio apropriado.
Coloque as placas na incubadora de cultura a 30 graus por 24 a 48 horas. Inocular essas culturas em dois mililitros de médio da raia fresca em um tubo de 15 mililitros e incuba-los durante a noite agitando a 200 RPM a 30 graus. Meça a densidade óptica da cultura no comprimento de onda de 600 nanômetros.
Leve o volume correspondente a 0,2 unidades de absorção em tubos estéreis Paleta células de levedura a 9.000 G por 30 segundos à temperatura ambiente. Descarte este supernatante. Lave as células com 0,5 mililitros de água estéril por vórtice por cinco segundos.
Células de levedura pallette a 9.000 G por 30 segundos em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso. Células diluídoras em dois mililitros de meio de ágar fresco.
A borda incubada é de 200 RPM e 30 graus até que a densidade óptica atinja de 1,5 a 1,9 de 1,5 a 1,9 graus. Transfira o volume de cultura equivalente a uma unidade óptica no tubo de micro centrífuga. Gire os tubos a 3000 G por um minuto.
Descarte o supernaspeso. Lave as células com 0,5 mililitros de água estéril por vórtice por cinco segundos. Células de levedura pallette a 9.000 G por 30 segundos à temperatura ambiente Descarte o supernasce.
Suspenda des suspenda as células de levedura em 0,5 mililitros de tampão de tradução estéril. Coloque a suspensão em tubo de 15 mililitros. Adicione cicloheximida à suspensão celular até a concentração final de 0,2 miligramas por mililitro Incubate por cinco minutos de borda tomada a 200 RPM e 30 graus para inibir a tradução citosolica.
Adicione de 25 a 30 Adicione de 25 a 30 microcurias de metanfetamina S35 de methionina S35 à suspensão celular e incubar por 30 minutos de borda tomada a 200 RPM e 30 graus. Adicione methionina fria sem rótulo e bormicina para parar a rotulagem Incubate por 10 minutos de borda tomada a 200 RPM e 30 graus. Coletar células de levedura por centrifugação a 9.000 G por 30 segundos.
Lave as células com 0,5 mililitros de água estéril por vórtice por cinco segundos. Células de levedura pallette a 9.000 G por 30 segundos em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso.
Adicione 75 microliters de tampão de lise à paleta e vórtice por cinco a 10 segundos. Adicione 500 microliters de 0,5 amortecedor molar tris de 0,5 amortecedor molar tris com pH 6.8. Com pH 6,8.
Vórtice brevemente. Adicione 600 microliters de metanol à amostra. Vórtice por cinco segundos.
Adicione 150 microliters de clorofórmio à amostra. Vórtice por cinco segundos. Centrifugar as amostras por dois minutos a 12.000 G.Descarte cuidadosamente opaface com um amostrador.
Adicione 600 microliters de metanol à amostra. Misture cuidadosamente invertendo o tubo várias vezes. Amostras centrífugas por dois minutos a 12.000 G.Descarte supernatante.
Atee o pouco o palette por dois minutos a 80 graus. Dissolver proteínas precipitadas em 60 microliters de tampão amostral de Laemmli. Aqueça as amostras por 10 minutos a 14 graus.
Cause o gel de poliacrilamida De 17,5% Laemmli SDS. Carregue 15 microliters de cada amostra nos bolsos. Execute o gel na sala fria até que o corante azul atinja aproximadamente 65% do linfático de gel.
Manche o gel com azul brilhante Kumasi e faça a varredura ou foto que é necessária como controle de carregamento. Seque o gel na secadora de gel. Mantenha-o no com tela de fósforo de armazenamento por três a cinco dias.
Escaneie a tela no imager fosforo. Seguindo o protocolo descrito acima, atribuímos produtos de tradução mitocondrial de duas cepas de Saccharomyces cerevisiae. O tipo selvagem e a exclusão da variante mutante do gene Aim23 codificando o fator de iniciação da tradução mitocondrial três.
Os produtos de tradução mitocondrial já foram ativamente rotulados e separados no gel de poliacrilamida desnaturação. As amostras foram coletadas a cada dois minutos e meio antes da saturação para construir o curso do tempo. O gel foi manchado, seco e exibido após os cinco dias de exposição.
No caso de um experimento bem sucedido, a imagem demonstra oito bandas atribuídas de acordo com o padrão padrão. No entanto, as intensidades das bandas individuais podem ser altamente variáveis dependendo da tensão e das condições experimentais. Cada banda corresponde a um produto de tradução.
Os dados sugerem que a cepa mutante é capaz de síntese de proteína mitocondrial porque todos os produtos que aparecem no tipo selvagem são visíveis neste mutante. No entanto, as intensidades das bandas são diferentes do tipo selvagem, o que significa que essa exclusão do Aim23 afeta a expressão genética mitocondrial. Kumasi fabricado em mancha azul e serve como um controle de carga.
Seu resultado em dados pode ser quantificado para identificar diferenças entre cepas ou condições experimentais usando o software Image G ou Image Quan. Para estes, a razão do sinal correspondente a cada produto é calculada para o sinal total. Valores médios e desvios padrão são calculados em pelo menos três experimentos independentes.
A cinética da proteína sintetizada virada é estudada em um experimento do ano passado. As amostras são coletadas nos pontos de tempo indicados após a reação de rotulagem ser interrompida por metoionina fria e boromicina. Este controle é necessário para estimar a estabilidade do produto.
A imuno-coloração com anticorpos anti-porin é um controle de carga. Descrevemos o método, que é frequentemente usado para estudar biossíntese de proteínas em mitocôndrias de levedura. Este protocolo é relativamente simples e rápido de executar.
Ao mesmo tempo, permite obter informações valiosas sobre a taxa de tradução de quatro mRNAs mitocondrial de levedura, o que é altamente vantajoso. No entanto, possui várias limitações que requerem experimentos adicionais e está nestes níveis interestaduais de proteínas e mRNAs. Ele pode fornecer as informações sobre essas funções no sistema de tradução mitocondrial, mas técnicas mais avançadas devem ser usadas para descobrir o mecanismo.
