Este método é significativo porque nenhum outro protocolo permite que o RNA recém-sintetizado seja analisado em uma escala de tempo tão curta, e permita experimentos de perseguição de pulso com um pulso tão curto. Este protocolo funciona bem com o esgotamento da proteína, como o protocolo Best AID 4U. A principal vantagem é que o fundo é baixo.
Isso permite os curtos tempos de rotulagem, removendo quase todos os RNA não-tiolatados. O protocolo escrito também detalha muitos tipos diferentes de experimentos que poderiam ser realizados e como integrá-los a essa técnica. Para iniciar este procedimento, cresça levedura em médio YMM para um OD 600 entre 0,6 e 0,8.
Em um capô de fumaça, adicione um metanol equivalente a 30 a 50% do volume amostral pretendido a um tubo de 50 mililitros. Feche os tubos firmemente, rotule-os e coloque-os em gelo seco para esfriar. Em seguida, rotule dois tubos mililitros para armazenamento a longo prazo das amostras e coloque no gelo para esfriar.
Adicione contas de zircônia aos dois tubos mililitros. Esfrie pelo menos um mililitro de água por amostra no gelo. Se um pico de S.pombe for adicionado à cultura, coloque uma alíquota de células de S.pombe no gelo para descongelar.
Vórtice o aliquot descongelado e adicioná-lo à cultura. Em seguida, adicione 4tU à cultura a uma concentração de 10 micromolares e misture vigorosamente. Rótulo de tio por um período de tempo entre 15 segundos e cinco minutos.
Pegue amostras da cultura em intervalos regulares até o final do curso de tempo. Adicione cada amostra a um dos tubos de centrífuga preparados contendo metanol. Sele cada tubo, agite para misturar bem e coloque em gelo seco.
Uma vez que todas as amostras tenham sido colhidas, coloque-as todas no gelo. Certifique-se de que nenhuma das amostras tenha congelado. Se algum tiver congelado, aqueça-os suavemente na mão enquanto inverte constantemente.
Centrifugar as células a 3.000 vezes g e a quatro graus Celsius por dois minutos para pelotar as células. Despeje o líquido e resuspense a pelota em pelo menos um mililitro de água gelada, esbobinando vigorosamente para cima e para baixo. Transfira a suspensão para o tubo de tampa do parafuso preparado e coloque o tubo no gelo.
Centrifugar as amostras brevemente a uma velocidade superior a 13.000 vezes g para re-pellet as células. Em seguida, colocá-los de volta no gelo, e remover o líquido. Primeiro, adicione 400 microliters de tampão AE, 40 microliters de SDS e 800 microliters de fenol a um pH baixo.
Resuspend por vórtice por 10 segundos. Em seguida, lise as células em um homogeneizador por três dois minutos rajadas no ajuste de potência mais baixo. Deixe as amostras no gelo por dois minutos entre pulsos de homogeneização.
Coloque as células lístidas em gelo seco por cinco minutos até solidificar. Em seguida, use um microcentrifuge para girar as células a uma velocidade superior a 13.000 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Após isso, realize extração de clorofórmio fenol e extração de clorofórmio conforme descrito no protocolo de texto.
Adicione entre 1/3 a 1/2 do volume de 10 cloreto de lítio molar e misture para precipitar o RNA. Centrifugar a uma velocidade superior a 13.000 vezes por cinco minutos. Remova o fluido e gire brevemente a amostra para remover a escória.
Em seguida, lave a pelota com 300 a 500 microliters de 70% de etanol. Centrifugar a pelota lavada brevemente, e remover qualquer etanol restante. Ressusurrea a pelota de RNA em 90 microlitadores de TE a um pH 7.0 aquecendo a 65 graus Celsius enquanto treme.
Depois de verificar se há solubilização completa do RNA, transfira a suspensão para um tubo de 0,2 mililitro. Para começar, biotinilação adicionando 10 microlitadores de solução HPDP-biotina ao RNA e misture completamente. Incubar no escuro a 65 graus Celsius por 15 a 30 minutos.
Em seguida, prepare uma pequena coluna de exclusão de volume de resina para excluir a biotina não incorporada. Remova a etiqueta inferior da coluna, solte a tampa e coloque a coluna em um tubo centrífuga de dois mililitros. Centrifugar a 1.500 vezes g por um minuto para limpar o buffer e descartar o fluxo..
Em seguida, adicione suavemente 0,3 mililitros de TE na parte superior da coluna e gire novamente usando as mesmas condições. Transfira a coluna lavada para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Quando a incubação da amostra estiver completa, adicione a amostra à parte superior da coluna.
Centrifugar a 1.500 vezes g por dois minutos, deixando a amostra de RNA biotinilada na parte inferior do tubo. Descarte a coluna. E adicione 1/3 a 1/2 volume de 10 cloreto de lítio molar ao tubo que contém a amostra.
Misture para re-precipitar o RNA. Primeiro, re-dissolver o RNA em 200 microliters de água tratada com DEPC. Meça a concentração de RNA e calcule os volumes de cada amostra que dará quantidades iguais de RNA para todas as amostras.
Adicione essa quantidade de RNA a um tubo fresco e adicione água tratada com DEPC de volta a um volume total de 200 microliters. Quando uma amostra estiver em temperatura ambiente, adicione 25 microliters de 10 x tampão NaTM, 25 microliters de um fosfato de sódio molar e 2,5 microliters de 10% SDS. Misture bem e centrífugue suavemente a aproximadamente 100 vezes g por menos de 30 segundos.
Prepare dois mililitros de tampão de contas para cada amostra com um tampão X NaTM, fosfato de sódio molar de 0,1 e SDS de 0,1%. Adicione 50 microliters de contas streptavidin a um tubo de baixa retenção de 1,5 mililitro. Coloque o tubo no rack magnético e espere as contas se instalarem.
Em seguida, remova o fluido por aspiração. Para lavar as contas, adicione 200 mililitros de tampão de contas e vórtice até que a pelota de contas esteja totalmente resuspendida. Centrifugar o tubo a aproximadamente 100 vezes g por um máximo de cinco segundos.
Coloque o tubo no rack magnético para permitir que as contas sejam capturadas pelo ímã. Remova o fluido por aspiração se houver um pequeno número de amostras. Despeje o fluido e depois aspire se houver muitas amostras.
Bloco com 200 microliters de tampão de contas, 10 microliters de glicogênio e 2,5 microliters de tRNA. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos enquanto gira a ponta ao final a velocidade moderada. Depois disso, remova o fluido e lave novamente, conforme descrito no protocolo de texto.
Resuspenda as contas da amostra e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos durante a rotação. Durante esta incubação, prepare um tubo fresco de 1,5 mililitro para cada amostra. Adicione 1/10 de volume de três acetato de sódio molar no pH 5.3 e 20 microgramas de glicogênio.
Centrifugar a aproximadamente 100 vezes g por três segundos. Remova o RNA desvinculado das contas e lave-os conforme descrito no protocolo de texto. Para elutar o RNA, adicione 50 microliters de 0,7 molar beta mercaptoetanol aos contas.
Após o vórtice e a centrifugação, coloque o chorume no rack magnético. Pipeta a solução contendo RNA nos tubos de centrífuga preparado de 1,5 mililitro. Elute mais uma vez como descrito anteriormente.
Em seguida, coloque a amostra de volta no rack magnético para remover contas residuais do RNA elucido e transfira o fluido para um tubo de centrífuga fresco e de baixa ligação de 0,5 mililitro. Misture a amostra. E então adicionar 2,5 volumes de etanol para precipitar nsRNA.
Após a mistura e incubação, centrífuga a uma velocidade de pelo menos 13.000 vezes g e a quatro graus Celsius por 20 minutos. Os rendimentos típicos de snRNA recuperados usando este protocolo são mostrados aqui. Observe que a recuperação do RNA no ponto zero é uma parcela muito pequena daquela recuperada de pontos de tempo mais longos, com apenas 0,3 microgramas de RNA sendo recuperados de aproximadamente 30 bilhões de células.
Após apenas 30 segundos de rotulagem, no entanto, mais do dobro do RNA é coletado do mesmo número de células. No traço bioanalílise, nossos precursores de RNA podem ser vistos como um pico perto de 1.000 nucleotídeos e um duplo de picos em 1.700 a 1.800 nucleotídeos. A abundância desses intermediários aumenta à medida que a tiaolação continua.
A thiolação é então realizada com amostras sendo colhidas em intervalos de 15 segundos desde o início da rotulagem de thio e o processamento da transcrição RNA ACT1 é monitorado. Como pode ser visto, pré-mRNA e lariats são gerados mesmo após apenas 15 segundos de rotulagem. Após cerca de 45 segundos a um minuto, a quantidade de lariats e pré-mRNA atinge o equilíbrio com o máximo dessas espécies de RNA sendo criadas por transcrição como são processadas por emenda.
Os passos mais difíceis são aqueles que envolvem as contas, lavando e bloqueando. Tenha cuidado para não perder as contas, ou deixá-las secar. Uma vez que você tenha purificado o RNA recém-sintetizado, você pode usar qualquer procedimento tradicional de análise de RNA.
Recomenda-se que você execute o RNA em um bioanalzer ou similar. Depois disso, normalmente usamos QPCR e RNA-Seq para analisar o RNA. Este método mostrou-se ideal para analisar a cinética do processamento de RNA.
Os passos mais perigosos são aqueles que usam fenol e clorofórmio na extração de RNA. Toda vez que você usar esses produtos químicos em um recipiente não selado, faça isso em um capuz de fumaça, e use roupas de proteção apropriadas, um jaleco e luvas. Tome cuidado especial para que não haja contas de zircônia na rosca do tubo da tampa do parafuso, pois isso levará a um vazamento.
