Este protocolo é projetado para determinar a localização subocondrial das proteínas mitocondriais de levedura, que é considerada como um passo fundamental durante a elucidação da função proteica mitocondrial. O protocolo é adequado para nossas cepas de levedura mantidas em diferentes condições de crescimento. Representando uma ferramenta poderosa para a pesquisa como o estudo das mitocôndrias.
Para começar, células de raia de estoque de glicerol armazenadas a 80 C, em uma placa de ágar YPD para isolar colônias únicas da tensão de interesse. E incubar a placa a 30 C por 2 a 3 dias. Prepare uma cultura inicial inoculando de 2 a 3 colônias individuais de placa de ágar YPD em um frasco de 100 ml Erlenmeyer contendo 10 a 30 ml de meio YPGal.
Incubar o frasco a 30 C por 24 horas com agitação vigorosa de 180 a 200 rpm. Diluir a cultura inicial em 1 L de médio YPGal fresco para uma densidade óptica inferior a 0,1 a 600 nm. Cultive as células a 30 C com tremor vigoroso de 180 a 200 rpm por cerca de 12 horas, até que a densidade óptica atinja de 1 a 1,5.
Realize o isolamento de mitocôndrias altamente purificadas como descrito no texto. E determinar a concentração proteica da preparação mitocondrial altamente purificada, usando o ensaio de Bradford, seguindo as instruções do fabricante. Ajuste a concentração proteica para 10 mg/ml com tampão SEM gelado.
Transfira 40 l de mitocôndrias altamente purificadas em quatro tubos de microcentrifuge pré-refrigerados e rotulados de 1,5 ml. Adicione 360 l de tampão SEM no primeiro e segundo tubos. E 360 l de amortecedor EM no terceiro e quarto tubos.
Utilizando o esquema de pipetação, conforme o texto, adicione 4 L de proteínas recém-preparadas no segundo e quarto tubo. Depois de misturar todos os tubos suavemente, incubar no gelo por 30 minutos com mistura ocasional. Para parar a atividade proteinase K adicione 4 L de 200 mM PMSF aos quatro tubos.
Centrifugar os tubos a 20.000 x g por 30 minutos a 4 C.E coletar o supernatante, sem perturbar a pelota, em um novo tubo de microcentrifuge prefritado de 1,5 ml. Em seguida, resuspense a pelota em 400 l de tampão SEM gelado. Para inativar os possíveis traços de proteinase K, precipitar o supernanato coletado e resuspensar a pelota com ácido tricloroacético a uma concentração final de 10% Incubar os tubos no gelo por 10 minutos.
Centrifugar o ácido tricloroacético tratou amostras por 10 minutos a 12.000 x g a 4 C.E depois de remover o supernascimento, resuspensar a pelota em 200 l de tampão amostral. Se o azul bromofenol ficar amarelo, adicione 1 a 5 l de base 1 M Tris, até ficar azul. Adicione 4 l de 200 mM PMSF a todos os tubos.
Armazene as amostras a 80 C até uma análise posterior por SDS-PAGE e mancha ocidental. Transfira 200 l de mitocôndrias altamente purificadas para um tubo de microcentrífuga pré-refrigerado de 1,5 ml. Diluir mitocôndrias uma vez com o tampão SEM gelado.
Usando um sonicator compatível com pequenos volumes, mitocôndrias sônicas 3 vezes por 30 segundos no gelo. Centrifugar a amostra por 30 minutos a 100.000 x g a 4 C.E coletar o supernatante em um novo tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 ml. Depois de rotular o tubo como S"para fração de proteína solúvel, mantenha o tubo no gelo.
Resuspense a pelota da etapa anterior em 400 l de tampão SEM gelado. Transfira 100 l da pelota resuspended em um novo tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 ml. Rotule o tubo como SMP"para fração de partículas subocondriais e mantenha o tubo no gelo.
Diluir os 300 l restantes de pelota resuspended uma dobra com carbonato de sódio de 200 mM recém-preparado. E incubar a amostra diluída no gelo por 30 minutos. Em seguida, centrifufique a amostra por 30 minutos a 100.000 x g a 4 C.Coleça o supernascer em um novo tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 ml.
Rotule a amostra como CS"para fração de sobrenante carbonato, e mantenha o tubo no gelo. Resuspense a pelota da etapa anterior em 400 l de tampão SEM gelado. E nomeie a amostra como CP"para fração precipitada de carbonato.
Precipitar todas as amostras com ácido tricloroacético a uma concentração final de 10% e incubar os tubos no gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugar as amostras por 10 minutos a 12.000 x g a 4 C.Depois de remover o supernaspe, resuspense cada pelota no buffer de amostra. Se o tampão de amostra ficar amarelo, adicione 1 a 5 l de base de 1 M Tris até ficar azul.
Adicione 1 l de 200 mM PMSF a todos os tubos e armazene a 80 C até uma análise adicional por SDS-PAGE e mancha ocidental. A fração mitocondrial bruta foi purificada na centrifugação gradiente de densidade de sacarose, e observou-se redução em outros contaminantes celulares. Mitocôndrias à conversão mitoplastia foram monitoradas pelo desaparecimento da proteína espacial intermembrana citocromo b2 na pelota.
Com a aparência concomitante no supernante. A degradação mediada pela proteinase K da proteína intermembrana Sco1 foi observada devido à interrupção da membrana externa por choque osmótico. A integridade da membrana mitocondrial externa foi confirmada pela proteção do citocromo b2 e Sco1 contra a degradação da proteinase K na fração de pelotas.
Da mesma forma, a proteção da proteína solúvel da matriz KGD confirmou a integridade da membrana mitocondrial interna. O perfil da mancha ocidental prx1 sugeriu localização mitocondrial dupla no espaço e matriz intermembrana. Mitocôndrias foram submetidas à sonicação e extração de carbonato para investigar a topologia das proteínas da membrana.
O derramamento integral de proteína de membrana permaneceu nas frações de pelotas. O KGD foi detectado na fração supernante. A detecção de proteína KGD na pelota deveu-se a variações de parâmetros de sônica que afetam a formação de SMPs.
Após o tratamento de carbonato de sódio, a fração DE KGD e SMP foi solubilizada e encontrada na fração supernante. O perfil da mancha ocidental prx1 sugeriu uma associação com a periferia da membrana. Para o sucesso do protocolo de fracionamento submitocondrial, é importante parar a atividade proteinase K após o inchaço hipotônico adicionando TPM às amostras.
Os sites fornecem informações sobre a localização da proteína subocondrial. Este protocolo também pode ser usado para verificar a integridade das preparações mitocondriais, o que é fundamental durante estudos proteômicos de subcomentamentos mitocondriais.
