Aqui, demonstramos o método Updegraff, o método mais utilizado no mundo para a estimativa do conteúdo de celulose cristalina. A celulose é basicamente composta de monômeros de glicose ligados por beta-1, 4 ligações glicossídicas. Dividimos este protocolo em cinco fases.
Na primeira fase, preparamos o material de biomassa vegetal. Na segunda fase, extraímos a parede celular bruta. Na terceira fase, utilizamos o tratamento Updegraff no qual o Updeenxerf é composto de ácido acético e ácido nítrico que ajuda na remoção de hemicellulose e lignina de nossas amostras.
Na quarta fase, submetemos-no à hidrólise ácida com a ajuda do ácido sulfúrico que produz os monômeros de glicose. Finalmente, na quinta fase, usamos ensaio de anthrone para estimar o conteúdo de celulose cristalina. Recolher o material vegetal da estufa, lavá-los cuidadosamente com água, secar o ar por dois dias, separar o tecido e transferir o tecido para os recipientes rotulados individualmente e incubar na incubadora a 49 graus centígrados por 10 dias.
Então, finalmente, corte em pedaços usando tesoura ou lâmina. Congele o tecido e carregue em argamassa e pilão para moagem fina em pó uniforme ou, alternativamente, use freezer/mill. Aqui, demonstramos usando freezer/mill, por isso carregamos nossas amostras de tecido nesses frascos de moagem e as colocamos no Freezer/Mill e executamos a velocidade de 10 CP por três ciclos.
O pó de tecido é coletado no tubo Falcão, como mostrado aqui. Pese 20 mg do pó de tecido e transfira para um tubo de dois mL pré-pesado. Adicione um mL de tampão de solubilização de proteínas para remover proteínas. vórtice.
Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte o supernaspeso. Repita este passo mais duas vezes.
Adicione um mL de água estéril à pelota retida. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Repita este passo mais duas vezes.
Adicione um ML de 70% de etanol à pelota retida. vórtice. Transfira para um bloco centígrado pré-aquecido de 70 graus com agitação simultânea por uma hora. Após uma hora de incubação, centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos.
Repita este passo mais uma vez. À pelota salva, adicione um mL de 100% de metilona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos.
Adicione um mL de metanol clorofórmio. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione um mL de acetona. vórtice.
Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Re-descarte o supernaspe e o ar seque-os a 37 graus centígrados durante a noite ou continue pela secagem a vácuo.
Carregue suas amostras no secador de vácuo e o ar seque por duas a três horas ou até que a pelota esteja completamente seca. Pesar cinco mg do extrato da parede celular obtido da etapa anterior. Transfira para um tubo de tampa de parafuso de dois mL.
Inclua também o controle positivo neste momento. Use dois mg de papel filtro Whatman para esse fim. Transfira para um tubo de tampa de parafuso de dois mL.
Adicione 1,5 mL de reagente Updegraff a cada extrato de parede celular pesado. Vórtice e incubar a 100 graus centígrados em um bloco pré-aquecido por 30 minutos. Após 30 minutos de incubação, transfira para um rack.
Deixe esfriar no banco por 10 minutos. Centrífuga a 15.000 RPM por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.
Adicione um mL de água estéril. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por 10 minutos. Descarte 500 microliters do supernante.
Adicione um mL de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte um mL do supernaspe.
Adicione um mL de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte o supernatante completamente.
Adicione um mL de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte o supernaspeso.
Seque a 37 graus centígrados durante a noite. Depois de uma incubação de uma noite, transfira para um rack. Adicione um mL de ácido sulfúrico de 67%. vórtice.
Incubar a 25 graus centígrados por uma hora com agitação simultânea. Após uma hora de incubação, certifique-se de que a pelota está completamente dissolvida. Transfira para um rack.
Este é o passo final da extração de celulose. Agora as amostras estão prontas para diluição amostral. Para diluição amostral, utilize 10 microliters de cada amostra da etapa anterior e adicione 490 microliters de água estéril.
Repita isso para todas as amostras experimentais. Para a preparação da curva padrão de glicose, prepare um estoque fresco de uma mg por glicose de 1 mL e prepare zero microgramas para 200 concentrações de microgramas adicionando um mg por mL de glicose em incrementos de 20 microliter e compõem o volume final para um mL com água estéril. Pegue 500 microliter de cada padrão preparado em um tubo de tampa de parafuso e adicione um mL 0,2% anthrone.
E agora as amostras estão prontas para o ensaio de anthrone. Adicione um mL de anthrone recém-preparado. Misture imediatamente por vórtice e transfira para o gelo.
Repita para todos os padrões e amostras da mesma forma. Em seguida, transfira para um bloco centígrado pré-aquecido de 100 graus por 10 minutos. Após 10 minutos de incubação, transfira para o gelo e incubar por cinco minutos no gelo.
Após a incubação, tome 200 microliters de cada amostra em três réplicas. Repita para ambos os padrões e amostras da mesma forma. E uma placa carregada de 96 poços foi carregada em um detector multimode.
Usando o programa Smart Max Pro, definimos a configuração do filtro para 620 nanômetros. Tipo de placa para 96-bem tipo. Selecione toda a área de leitura.
Clique em OK. ler. Leia a placa. Você obtém as leituras de absorvência de ambos os padrões e amostras, que serão coletadas na folha do Excel para análise e estimativa do conteúdo de celulose.
A curva padrão de glicose é preparada utilizando-se as concentrações de glicose em microgramas por mL no eixo x e os valores de absorção normalizados da respectiva concentração em 620 nanômetros no eixo y. Temos a linha de regressão com valores m e c no gráfico de dispersão plotado que usamos para estimar o conteúdo de celulose cristalina amostral. Na primeira etapa, tivemos uma média dos valores de OD em 620 nanômetros.
E então normalizamos os dados subtraindo o valor em branco. Calculamos que a concentração de glicose usando a fórmula x é igual a OD menos c/m onde conectamos os valores c e m da etapa anterior da linha de regressão na curva padrão. Como o volume total utilizado para o ensaio de anthrone é de 500 microliters, dividimos-o pelo fator de diluição dois.
Como o volume amostral utilizado foi de apenas 10 microlitadores, vamos dividir ainda mais por 10 para obter microgramas por concentração de microliter de glicose que é igual a mg por mL concentração. E então usamos o fator umidade 1.11 que é o ganho de umidade no processo. E, finalmente, calculamos o percentual de teor de celulose cristalina dividindo-o com o peso da parede celular, que é perto de cinco mg, e multiplicamos por 100 para obter o percentual.
Em seguida, fizemos uma média do teor de celulose cristalina de três réplicas biológicas para obter o valor das amostras individuais, que serão comparadas com outra média de linha experimental de três réplicas biológicas. E o teste t pode ser usado para testar seu nível de significância. Aqui na tabela A, mostramos os valores de tabela da concentração e os respectivos OD em 620 nanômetros, que foi ainda utilizado para traçar um gráfico de dispersão e uma linha de regressão com os valores m e c que foram utilizados no C para a obtenção das diferenças de teor de celulose entre as duas linhas experimentais.
Em conclusão, ambas as amostras apresentam diferenças de celulose. Obrigado por assistir.
