A imagem microscópica foi realizada através dos serviços do Estado Centro Universitário Michigan for Advanced Microscopia. Milho calo foi comprado a partir do Centro de Transformação de milho de Iowa State University. Os autores gostariam de agradecer Jeffrey R. Weatherhead do Laboratório de Pesquisa de Plantas MSU para a sua assistência técnica na análise de carboidratos. Esta pesquisa foi generosamente financiada pelo Programa Milho de Marketing de Michigan (CMPM) eo Consórcio para Plant Biotechnology Research (CPBR).

1. Preparação de dsRNAi construções usadas para o Down-regulação da ZmCCR1 <ol><li> Primers específicos do gene projeto, incluindo sítios de enzimas de restrição necessários para fazer uma dsRNAi construir a knock-out do gene ZmCCR1. Dois conjuntos de iniciadores foram concebidos para amplificar dois segmentos de fragmentos de cDNA ZmCCR1:. Um fragmento 523 bp a partir de nucleótidos 748-1271, e um fragmento de 285 pb a partir de nucleótidos 986-1271 O ZmCCR1 cDNA foi fornecido pelo Instituto Genoma Arizona (AGI). Mais detalhes são descritos na Figura 1. </li><li> Amplificar o fragmento grande de polimerase de reacção em cadeia (PCR) a partir do modelo de cDNA usando os ZmCCR1 ZmCCR1_748F_BglII iniciadores (5&#39;-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &#39;) e ZmCCR1_1271R_NcoI (5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&#39;). Amplificar o fragmento menor (285 pb), utilizando os iniciadores ZmCCR1_986F_BglII (5&#39;-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &#39;) e um ZmCCR1_1271R_SacI (5R17; GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT--3 &#39;). </li><li> Individualmente ligar os fragmentos de em pGEM-T Easy, seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Realizar mini-preparação de plasmídeo de isolamento de ADN a partir de transformantes individuais, cada uma contendo o pGEM-T constrói usando um kit comercial plasmídeo mini-prep. </li><li> Digerir tanto o pGEM-T :: ZmCCR1 (523 pb) e ImpactVector (IV) -1.1 (expressão citoplasma vetor) com tanto BglII e Ncol. </li><li> Ligar o grande digerido purificado em gel ZmCCR1 fragmento (523 bp) em gel digerido purificado IV-1.1. </li><li> Digerir o pGEM-T :: ZmCCR1 (285 pb) e IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 pb) com ambos BglII e Saci, a fim de inserir o pequeno fragmento no IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 pb). </li><li> Ligar o pequeno fragmento purificado em gel digerido ZmCCR1 (285 bp) em gel digerido purificado IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 pb). </li><li> Clone ambos 523 pb e 285 pb fragmentaçãots em IV-1.1 para fazer o ZmCCR1 RNAi construção, que tem uma sequência de repetição invertida 285 pb 238 pb com um espaçador no meio dos fragmentos de repetição invertida (ver Figura 1). </li><li> Transferir esta construção em Escherichia coli (E. coli), cultivá-los e efectuar um tamanho de isolamento de DNA de plasmídeo midi-prep para obter DNA de plasmídeo suficiente para a transformação genética de milho. </li></ol> 2. Milho Transformação Genética <ol><li> Preparação de Partículas de tungstênio <ol><li> Colocar 60 mg de esferas de tungsténio (M10) em um tubo de 1,5 ml e lava-se com 1 ml de etanol a 70% em vortex durante 2 min. Incubar durante 10 minutos a 23 ° C e depois centrifugar a 18,894 xg durante 2 minutos e descarta-se o sobrenadante. </li><li> Lavar 3x com 1 ml de etanol 100%, centrifugando durante 2 min e rejeitando o sobrenadante. Adicionar 1 ml de glicerol a 50% estéril para levar a concentração de micropartículas até 60 mg / ml. </li></ol></li><li> Preparação de DNA para bombardeamento <ol><li> Place os 50 ul (3 mg) de esferas de tungsténio preparadas, em glicerol a 50% em um tubo de 1,5 ml. Adicionam-se 5 ul (1 ug) de IV-1.1 :: ZmCCR1 RNAi plasmídeo de DNA, 50 uL de 2,5 M de CaCl2, e 20 pi de espermidina 0,1 M. Vortex brevemente entre cada adição dos reagentes acima. </li><li> Vortex o tungstênio-DNA talão mistura brevemente e centrifugar a 18.894 xg por 30 segundos. Decantar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 140 ul de etanol a 70%. Remover o líquido e descartar. Adicionar 140 ul de etanol a 100%. Remover o líquido e descartar. </li><li> Adicionar 48 ul de etanol a 100%. Use imediatamente ou armazenar no gelo por até 4 horas antes da bombardeio. </li></ol></li><li> Bombardeamento <ol><li> Colocar 3-5 cm de diâmetro Hi-II de calos de milho embriogénico (fornecida a partir de milho Centro transformação de Iowa State University) no meio de 100 mm em placas de Petri contendo meios de comunicação N6OSM 32 (como osmotium) pelo menos 4 horas antes do bombardeamento. </li><li> Prepare o dispositivo de entrega de partículas PSD-1000/He de acordo com as instruções do fabricante 33. </li><li> Esterilizar parede da câmara com etanol 70%. Carregar estéril disco de ruptura de 650 psi em cap retenção estéril. Espalhe 5-6 ul da solução de M10-ADN para a superfície de um microtransportador, brevemente seco. Carga microtransportador e parando tela em microcarregador montagem lançamento. </li><li> Coloque microcarregador montagem lançamento e calos de milho em câmara a uma distância selecionada a partir da tela de parada (L2 = 6 cm) e feche a porta. Acelerar a um vácuo de 27 psi contra uma tela de malha de arame. </li><li> Pressione o botão de fogo até rajadas de disco de ruptura e pressão de hélio indicador cai para zero. Solte o botão de fogo. </li><li> Incubar os calos bombardeados numa placa de Petri contendo N6OSM (meio osmótico) 32 durante 16 horas no escuro a 27 ° C. Quebre o calos em cerca de dez peças e transferir para N6E (meio de indução de calos) 32 em placas de Petri e incubar durante 5 dias in escuro a 27 ° C. </li></ol></li><li> Seleção <ol><li> Depois de 5 dias em N6E, transferir os calos em meio N6S (mídia seleção) 32. Subcultura todos os calos em meio de selecção, a cada 30 dias durante 8-12 semanas, sem perturbar a estrutura de formação de calos. </li><li> Depois de cerca de 8-10 semanas, branco sectores de rápido crescimento vai crescer fora da não-proliferação e calos mãe parcialmente necrótica. Especial sobre o consumo dos tecidos de crescimento rápido brancos e subcultura-los a médio seleção fresco (N6S) 32 e continuar a incubar como acima. </li></ol></li><li> Regeneração <ol><li> Transferir os calos embrionário branco e de crescimento rápido em meio de regeneração e incubar 32 como acima, durante 1 semana. Desligue o calos embriogênicos regenerar a um período de 16 horas luz do dia e 8 horas escuro, a 25-27 ° C </li><li> Transfira a regeneração atira para o enraizamento médio de 32 em um tubo de ensaio de vidro após 3-4 semanas, continuam a incubar como acima. Após substancial rdesenvolvimento oot aparece, lavar cuidadosamente as raízes sob a água da torneira, depois transplantar as mudas para 4 &quot;vasos com terra. Cubra os vasos com sacos plásticos para manter úmida. Após 2 dias fazer pequenos furos os sacos de plástico. Depois de 5-6 dias remover os sacos de plástico. Continue-se a incubar conforme acima por mais 5-6 dias. </li></ol></li><li> Estufa <ol><li> Transfira as mudas em vasos de 18 &quot;com o solo e manter sob a luz solar ou à luz verão cheio de efeito estufa. As plantas regeneradas iniciais são chamados t 0, enquanto as primeiras sementes pertencem à geração T 1. </li></ol></li></ol> 3. Ensaio histológica <ol><li><ol><li> Corrigir os de milho folha meados da década de costelas em 5 ml de 10% formalina tamponada neutra. </li><li> Processo e vácuo infiltrar com parafina com um processador de tecido usando um processador de tecidos. </li><li> Incorporar os tecidos em parafina usando uma estação de incorporação HistoCentre III. </li><li> Remover o excesso de parafina a partir das bordas, uma vez blocoks são arrefecidos. </li><li> Seção amostra em 4-5 mM com um micrótomo usando um micrótomo. </li><li> Coloque secções sobre lâminas de microscópio e seco em uma incubadora a 56 ° C durante 2-24 horas. Fazer seções certeza são totalmente aderida ao slide. </li><li> Retire a parafina secções em duas mudanças de xileno durante 5 min a 23 ° C. </li><li> Hidrato desliza através de duas mudanças de etanol a 100% durante 2 min e duas mudanças de etanol a 95% durante 2 minutos a 23 ° C. </li><li> Lavar as seções em água corrente por 2 min. </li><li> Mancha com 0,05% de toluidina O azul para 1-2 minutos e enxaguar rapidamente com DDH 2 O. </li><li> Coloque uma lamela sobre as amostras com óleo de imersão e visualização com microscopia de luz. </li></ol></li><li> Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) <ol><li> Fixar as folhas de milho meados nervuras transversas em 4% de glutaraldeído e 0,1 M de tampão fosfato de sódio (pH 7,4) a 4 ° C durante 1-2 horas. </li><li> Resumidamente enxaguar as amostras do tampão, desidratou-los numaséries de etanol (25%, 50%, 75% e 95%) durante 10-15 minutos em cada gradação e etanol a 100% durante 10 min, 3x. </li><li> Seque as folhas de milho meados costelas seccionadas-cross desidratadas em um secador de ponto crítico com dióxido de carbono líquido como fluido de transição. </li><li> Monte as amostras secas em topos de alumínio usando guias de carbono de alto vácuo </li><li> Revista as folhas de milho meados costelas montadas em bases de alumínio com ouro (cerca de 20 nm de espessura) em um coater pulverização catódica purgado com gás argônio. </li><li> Examine as amostras revestidas em um JEOL JSM-6400V (lantânio hexaboreto emissor de elétrons) microscópio eletrônico de varredura. </li><li> As imagens digitais foram fotografados usando um software de análise Pro (versão 3.2). </li></ol></li></ol> 4. Klason lignina Medição <ol><li> Moinho das amostras através de uma tela de 2 mm. </li><li> Use um analisador de umidade para determinar o conteúdo de cada amostra de umidade e gravar o valor. </li><li> Pesar ~ 1,5 g de cada amostra e registrar a massa. Extrair as amostras usando água para a primeira extracção, seguida de etanol para a segunda extracção usando um solvente de extracção automática (3 ciclos por extracção, ~ 14 minutos por ciclo) ou aparelho de Soxhlet (8 horas por extracção). (Nota: Esta etapa remove extrativos que podem condensar durante a hidrólise ácida e interferir com a medição precisa de lignina, aumentando o teor de lignina Klason aparente.) </li><li> Seque as amostras extraídas a 45 ° C durante a noite, em seguida, deixe esfriar no dessecador, e pesar novamente. </li><li> Definir uma incubadora a 30 ° C. Meça 0,3 g de cada amostra seca, extraído em tubos de alta pressão com tampa (triplicatas por amostra é recomendado) e registrar os pesos para a aproximação de 0,1 mg. Adicionar 3 ml de 72% de H 2 SO 4 a cada tubo de pressão. </li><li> Misturar a amostra usando um copo ou vara Teflon mexa. Deixe a vara agitação no tubo até que a água é adicionado após incubação. </li><li> Coloque os frascos em uma incubadora set para 30 ° C e 150 rpm durante 60 min. Depois de 1 hora adicionar 84 ml de água desionizada, para diluir a concentração de ácido de 4% e misturar-se com a vareta de agitação. Ter cuidado para não deixar grandes quantidades de amostra sobre os lados do frasco acima da linha de água. </li><li> Fortemente selar as rolhas em todos os frascos e colocá-los em um rack de metal ou de grandes copos. Autoclave a 121 ° C por meio de um ciclo de esterilização líquido, durante 1 hora. Deixar arrefecer à temperatura ambiente antes de abrir. </li><li> Pré-ash os cadinhos de filtragem em um forno a 575 ° C durante pelo menos 4 horas. Permitir cadinhos a arrefecer-se num exsicador durante pelo menos uma hora. </li><li> Aspirador de filtrar a solução a partir de cada tubo através de um cadinho separado, usando um adaptador de borracha para fixar o cadinho. Use água deionizada para enxaguar todas as partículas restantes do tubo. </li><li> Seca-se o resíduo de lenhina a 105 ° C durante um mínimo de 4 h. Registar o peso do cadinho e seco resíduo. </li><li> Se estiver usando um 575 ° C, pré-Fogo as amostras mais de um bico de Bunsen até que não haja fumaça ou cinzas e, em seguida, colocar no forno por 24 horas, ou se estiver usando um forno programável, não pré-cinzas e usam o seguinte programa: </li><li> Rampa desde a temperatura ambiente até 105 ° C e manter por 12 minutos. </li><li> Rampa até 250 ° C a 10 ° C / min e mantenha durante 30 minutos. </li><li> Rampa até 575 ° C a 20 ° C / min e manter durante pelo menos 180 min. </li><li> Retirar os cadinhos a partir do forno e arrefece-se num exsicador. Pesar o cadinho e cinzas. </li><li> Calcula-se o resíduo insolúvel ácido usando a seguinte equação: </li></ol><img alt="Equação 1" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" /> M PRE = Massa da biomassa pré-extraído M POST = Massa da biomassa pós-extraído M VIAL = Massa de biomassa extraída adicionada ao frasco M = Massa RESÍDUO de resid cadinho e ligninaue M = Massa ASH de cadinho e cinzas MC = teor de umidade da biomassa pré-extraído, base de peso total 5. Análise Carboidratos <ol><li> Realize parede celular de carboidratos analisa baseado no Foster et al. (2010) Protocolo de 31. Em resumo, Prepare álcool resíduo insolúvel de liofilizado material vegetal. Em seguida hidrolisar o material com ácido trifluoroacético e combinar os derivados de monossacáridos solubilizados para os seus acetatos de alditol correspondentes. Analisar estes derivados voláteis por cromatografia gasosa (GC) conectada a um espectrômetro de massa quádruplo. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A acessibilidade de celulases microbianas para plantar polissacáridos da parede celular está em grande parte dependente do grau ao qual estão associados com polímeros fenólicos 23. A taxa de conversão de biomassa lignocelulósica para fermentáveis ​​açúcar está negativamente correlacionada com o teor de lignina depositado na parede celular secondadry plantas. Esta correlação é atribuída às propriedades físicas da lignina tais como hidrofobicidade 24, heterogeneidade química, e ...

A produção de biocombustíveis a partir da biomassa lignocelulósica é altamente desejável, devido à sua abundância presente em os EUA 1, e, no caso de a colheita sustentável de resíduos agrícolas e florestais, a capacidade de não competir diretamente para terras agrícolas utilizadas para a produção de alimentos e rações animais. No entanto, ao contrário dos grãos de milho, que é a principal fonte de biocombustível momento gerado em os EUA, materiais lignocelulósicos são significativamente mais complexo e difícil de quebrar. Além do hidratos de carbono de cadeia longa, a celulose e hemicelulose, que são as principais fontes de açúcares durante a fermentação de materiais lignocelulósicos, muitos tipos de paredes de células de planta também contêm lenhina, um polímero que proporciona a força de fenilpropanóide, a defesa contra o ataque patogénico, e hidrofobicidade as paredes celulares. Embora necessários para o crescimento e sobrevivência da planta, lignina também apresenta uma barreira significativa para a conversão enzimática de sucesso da celulose e hemicelluperder para açúcares solúveis. Materiais com alto teor de lignina são geralmente materiais menos desejáveis, tanto para o biocombustível (através de vias de conversão biológica) e as indústrias de papel e celulose, devido aos impactos negativos sobre as características de processamento e qualidade do produto. Assim, a manipulação genética dos materiais vegetais para a redução de lignina a um nível que não interfira com a resistência estrutural das culturas e sistemas de defesa poderia ser importante para a redução de custos de produção, tanto para o biocombustível lignocelulósico e as indústrias de papel e celulose. No milho (Zea mays), a lenhina é covalentemente reticulada a hemicelulose na parede celular primária através de ácido ferúlico e pontes diferulate 2. O complexo de lignina-hemicelulose se liga a microfibrilas de celulose por meio de ligações de hidrogénio, formando uma matriz complexa que confere integridade e resistência da parede celular secundária. A resistência mecânica das paredes das células de planta é fortemente determinada pelo tipo de lignin subunidades 3-5. Em estudos anteriores, alterando as proporções de subunidades lignina mostrou nenhuma tendência clara sobre a digestibilidade enzimática 6-11. No entanto, reduzir o teor de lignina apresentam geralmente uma melhoria em conversões 12,13 e pode ser a chave para o aumento da digestibilidade do material vegetal por enzimas hidrolíticas incluindo endocellulases, celobiohidrolases, e β-glucosidases 14. A engenharia genética para regular o nível de transcritos de expressão tem sido amplamente praticado para melhorar as características de cultura. Técnicas avançadas, incluindo anti-sense 15 e co-supressão de 16 tecnologias, permitir eficaz infra-regulação de genes alvo. Completa gene knock-out também foi alcançado usando construções de genes que codificam RNA emendados-intron com uma estrutura hairpin 17. Além disso, uma dupla interferência de RNA encalhado (dsRNAi) técnica, ou seja, um poderoso e eficaz mídia expressão gênicator que funciona por um ou outro visando a degradação transcrição ou tradução repressão, fornece um meio potente para induzir uma ampla gama de efeitos de supressão do mRNA alvo 18. Técnicas de silenciamento de genes mostram várias limitações. Estas técnicas não são reguladas com precisão o nível de transcrição e pode causar efeitos de silenciamento inesperadas em outros genes homólogos. Neste método, utilizou-se o bombardeamento de partículas para realizar a dsRNAi construções no genoma de milho. Até à data, uma vasta gama de espécies de plantas têm sido transformadas com sucesso usando bombardeamento de partículas, transformação mediada por Agrobacterium, electroporação, microinjecção e métodos. Na transformação genética de milho, o método de bombardeamento de partículas é vantajoso sobre todos os outros métodos, pois é o mais eficiente. O bombardeamento com partículas não é dependente de bactérias, de modo que o método é livre de restrições biológicas, tais como o tamanho dos genes, espécies de gene ouigin, ou o genótipo da planta. O sistema de entrega de transgene física permite alta de DNA de peso molecular e de múltiplos genes a ser introduzido no genoma da planta e, em certos casos em cloroplastos de alta eficiência de transformação 19. A redução de lignina no sistema vascular da folha no meio da nervura podem ser visualizados por microscopia electrónica de varrimento (SEM), o que é benéfico para a análise da topografia e composição das amostras. Em plantas de milho, dois dos cinamoil-CoA redutase (ZmCCR1: X98083 e ZmCCR2: Y15069) os genes foram encontradas no genoma de milho 20. Cinamoil-CoA redutase catalisa a conversão dos ésteres hidroxicinamoil-CoA em aldeídos cinamilo. Escolhemos o gene ZmCCR1 para regular esta enzima, porque o gene é expresso em todos os tecidos lignifying. Os 523 nucleótidos no terminal 3 &#39;do gene ZmCCR1 foram escolhidos para um dsRNAi construir porque as sequências parecia sermais diversificada em comparação com aqueles da ZmCCR2. Assim, a construção dsRNAi seria precisamente ligar apenas para ZmCCR1, evitando off-alvo silenciando 21. Um construto ZmCCR1_RNAi foi manipulada no ImpactVector1.1-tag sistema de expressão citoplasmática (IV 1,1) contendo o promotor específico de tecido verde, a ribulose-1, 5-carboxilase oxigenase-bisfosfato (RuBisCO). Para estudar os efeitos da dsRNAi construção de plantas transgénicas, o teor de lenhina foram quantificadas. A medição de lenhina de Klason (ácido insolúvel) é conhecido por ser mais preciso em comparação com os métodos de quantificação de ácidos detergente lignina que solubilizam alguma da lenhina 22. Portanto, a lenhina de Klason foi medido em caules de milho transgénicas. Este procedimento consiste de uma hidrólise ácida de dois passos que converte os hidratos de carbono poliméricos solúveis em monossacarídeos 23. A biomassa hidrolisada foi então fracionado em materi solúveis e insolúveis ácidoals e da lignina insolúvel em ácido foi medida de acordo com estudos anteriores 23,24. Idealmente, a análise de lenhina deve incluir extracções com água e etanol antes do passo de hidrólise, a fim de remover materiais solúveis que podem interferir com os resultados, e uma combustão pós-hidrólise do resíduo de lenhina para contabilizar quaisquer cinzas presentes no resíduo. Sem estes passos, o teor de lenhina da amostra pode ser artificialmente. O método integral é aqui apresentado, no entanto, para as nossas experiências fomos capazes de realizar ambos os passos devido à pequena quantidade de material disponível para testes Dois outros componentes da parede celular, celulose e hemicelulose foram também analisadas na lignina regulada linhagens de milho transgénico. Tem sido relatado que as plantas transgénicas que foram regulados negativamente em ambos os seus fenilalanina amónia-liase (PAL) 25, 4-cumarato: CoA ligase (4CL) 26, ou um cinamilolcohol desidrogenase (CAD) 27 mostram um aumento em outros componentes estruturais da parede celular. Como um primeiro passo para os nossos estudos, celulose cristalina foi medida usando o método Updegraff 28. Este método foi originalmente concebido para a determinação de celulose em um grande número de bactérias celulolíticas e fungos. Resumidamente, os estoques de milho moídos foram tratados com Updegraff reagente (ácido acético: ácido nítrico: água) para remover a hemicelulose, lignina, e xylosans. A celulose cristalina foi completamente hidrolisada em glicose através Saeman hidrólise por adição de H 2 SO 4. A celulose cristalina foi então analisado utilizando o método colorimétrico de antrona 29. Para verificar se o conteúdo de hemicelulose foram alterados, os extractos de monossacárido de talos moídos foram hidrolisadas utilizando ácido trifluoroacético, derivatizados utilizando o método de acetato de alditol e, em seguida, analisado por cromatografia gasosa (GC) de 30. Os procedimentos detalhados para cel cristalinaanálises de composição de conteúdo lose e polissacáridos de matriz são descritos em Foster et al. (2010) 31. Aqui, descrevemos os procedimentos utilizados para a lignina baixa regulação no milho por meio de uma tecnologia de RNAi, transformação bombardeamento de partículas e análise de lignina para a desconstrução acelerada de milho biomassa lignocelulósica em açúcares fermentáveis ​​para biocombustíveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

Para facilitar a utilização de biomassa lignocelulósica como um recurso bioenergia alternativa, durante os processos de conversão biológica, um passo de pré-tratamento é necessário para abrir a estrutura da parede celular das plantas, o aumento da acessibilidade dos hidratos de carbono de parede celular. A lignina, um material de polifenóis presente em muitos tipos de parede celular, é conhecida por ser um obstáculo significativo para a enzima de acesso. Redução no teor de lignina para um nível que não interfira com a integridade estrutural e a defesa do sistema da planta pode ser um passo importante para reduzir os custos de produção de bioetanol. Neste estudo, foram geneticamente regulada para baixo um dos genes relacionados com a biossíntese da lenhina, cinamoil-CoA redutase (ZmCCR1) por meio de uma técnica de cadeia dupla de RNA de interferência. O constructo ZmCCR1_RNAi foi integrado no genoma do milho utilizando o método de bombardeamento de partículas. As plantas de milho transgénicas cresceram normalmente, em comparação com as plantas de controlo do tipo selvagem, sem noterfering com o crescimento da biomassa ou de mecanismos de defesa, com exceção da exibição de marrom-coloração em transgênicos plantas de folhas meados de costelas, cascas e caules. As análises microscópicas, em conjugação com o ensaio de histológica, revelou que as fibras esclerenquimáticas foliares foram desbastadas, mas a estrutura e tamanho de outros componentes principais do sistema vascular não foi alterada. O teor de lignina no milho transgénico foi reduzida em 7-8,7%, o teor de celulose cristalina foi aumentada em resposta a uma redução da lignina, hemicelulose e manteve-se inalterada. As análises podem indicar que o fluxo de carbono podem ter sido desviadas da biossíntese de lignina para a biossíntese de celulose. Este artigo traça os procedimentos utilizados para regular o teor de lignina em milho através de tecnologia RNAi, e as análises de composição da parede celular utilizada para verificar o efeito das modificações sobre a estrutura da parede celular.

Nós demonstramos uma redução do teor de lignina em plantas de milho via RNAi. O método de transformação de bombardeamento de partículas produziram cerca de 30% de eficiência trnasformation. O silenciamento de genes de ZmCCR1 foi observado de forma consistente em gerações T0-T2. A lignina reduzida transgênicos cresceu de forma semelhante a plantas de milho de tipo selvagem, exceto para a exibição de coloração marrom na folha mid-rib, casca e tronco. O ensaio histológico mostrou que as linhas muta...

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Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A interferência de RNA fita dupla (dsRNAi) técnica é empregada para baixo-regular a coenzima A redutase cinamoil milho gene (ZmCCR1) para diminuir o teor de lignina da planta. A lignina sub-regulação da parede da célula é visualizada por meio de análises microscópicas e quantificada pelo método de Klason. São analisadas as mudanças de composição em hemicelulose e celulose cristalina.

A lignina Down-regulação da<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi e Klason Análise lignina

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

13.3K visualizações.  University of Arizona.  A interferência de RNA fita dupla (dsRNAi) técnica é empregada para baixo-regular a coenzima A redutase cinamoil milho gene (ZmCCR1) para diminuir o teor de lignina da planta. A lignina sub-regulação da parede da célula é visualizada por meio de análises microscópicas e quantificada pelo método de Klason. São analisadas as mudanças de composição em hemicelulose e celulose cristalina. 

Vídeo: Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

O ultra-som contraste Targeted Tratamento de Gliomas em camundongos através de Drogas Levando-entrega de nanopartículas e Ablação Microvascular

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Bioengenharia

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificação da função global diastólica por análise baseada em Modelagem cinemática de transmitral fluxo através do formalismo de enchimento parametrizada diastólica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

Estudar Soft-matéria e Sistemas Biológicos longo de um comprimento escala larga de nanômetros e micrômetro Tamanhos no pequeno ângulo Neutron Difractï¿½etro KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

Montagem rápida, escalável e carregamento de proteínas bioativas e Imunoestimuladores em diversas Nanocarriers sintéticas através de Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivos de campo elétrico e magnético para estimulação de tecidos biológicos

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&amp;#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

Inativação de Patógenos via Fotólise de Luz Visível de Riboflavina-5′-Fosfato

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

Engenharia de Agentes Antivirais via Ressonância de Plasmon de Superfície

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...