Este método usa fluorescência para determinar se uma transferência de proteína para liqids biologicamente importantes entre membrana sintética e, assim, contribuir para a distribuição desses lipídios dentro de células eucarióticas. Esta técnica torna possível a extração e o transporte de um lipídio natural por uma proteína, requer e células de fluorescência e lipossomos que são fáceis de fazer. Este método pode ser usado e modificado para obter uma visão da biologia celular por proteínas por trás da distribuição de alguns lipídios essenciais entre órgãos e membranas.
A demonstração visual é fundamental para explicar como realizar medições em tempo real da transferência de lipídios por fluorescência. Então, demonstrando o procedimento também será Maud Magdeleine, uma engenheira do meu laboratório. Comece preparando um tampão de acetato de potássio HEPES filtrado fresco e desafosado, complementado com um cloreto de magnésio milimila para formar o tampão HKM.
Em seguida, prepare lipossomos feitos apenas de PC ou adicionalmente dopados com dois porcentres molares PS ou PI(4)P. Agora, coloque o frasco em um evaporador rotativo para secar o lipídio sob vácuo. Em um poço, misture lipossomos contendo dois PS molar por cento com sensor lipídeto, NBD-C2 Lact, a uma concentração final de 250 nanomolares e um volume de 100 microliters.
Encha um segundo poço com a mesma quantidade de liposema e lact NBD-C2 misturado com três proteínas de transferência lipídica micromolar ou LTP. Encha um terceiro poço com 250 lact NBD-C2 nanomolar misturado com lipossomas de PC micromolar puros e um quarto poço com lipossomos puros de PC de 80 micromolar. Repita estas etapas para preparar três séries adicionais de quatro poços.
Em seguida, coloque a placa multi-bem no leitor de fluorescência. Para cada poço registe um espectro NBD de 505 a 650 nanômetros com uma largura de banda de cinco nanômetros após excitação a 490 nanômetros a 25 graus Celsius. Para cada série subtrair o espectro registrado apenas com lipossomos dos outros espectros.
Para o ensaio de extração PI(4)P prepare lipossomos dopados com dois molar por cento fosphatidylinositol-4-fosfato e realize medições com a sonda FAPP NBD-PH. Realize experimentos de controle e determine a porcentagem de extração. Depois de terminar de extrudar lipossomos encher um tubo com esses lipossomos extrudados.
Prepare o tampão HKM recém-desa gaseado e filtrado e mantenha os tubos contendo lipossomos extrudados à temperatura ambiente. Enrole tubos contendo lipossomos com fosfamina rotulada fosfattidylethanolamina em papel alumínio e armazene-os em uma caixa opaca para evitar qualquer branqueamento fotográfico. Ajuste a temperatura entre 25 e 37 graus Celsius e ajuste os monocromômetros de excitação para 460 nanômetros com uma largura de banda curta de um a três nanômetros e emissão para 530 nanômetros com uma grande largura de banda superior a 10 nanômetros.
Ajuste o tempo de aquisição para 25 minutos com a resolução de tempo de no máximo um segundo. No cuvette de quartzo dilui 30 microlitadores da suspensão liposasomea la e solução de estoque de lact NBD-C2 e tampão HKM pré-warm para preparar uma amostra de 570 microliteres que contém 200 lipídios totais micromolar e 250 lact nanomolar ou NBD-C2. Adicione uma pequena barra de agitação magnética e posicione a cuvette no suporte do fluorômetro.
Uma vez que a amostra esteja termicamente equilibrada, acione a medição. Após um minuto, adicione 30 microliters da suspensão liposasome LB à amostra. Após três minutos injete LTP na amostra para que a concentração final do LTP seja de 200 nanomolares e, em seguida, adquira o sinal durante os 21 minutos restantes.
Realize um experimento paralelo para normalizar o sinal NBD. Misture 30 microliters de suspensão lipossomo de equilíbrio la com 250 lact NBD-C2 nanomolar em tampão HKM em um volume final de 570 microliters. Após um minuto, injete 30 microliters de suspensão liposesome de equilíbrio LB.
Converta as curvas cinéticas medidas com um LTP de interesse para determinar a quantidade de PS transferida de la para lipossomos LB ao longo do tempo. Em seguida, normalize cada ponto de dados da curva. Realize o experimento PI(4)P usando as mesmas configurações e condições do emissor do piso quanto ao ensaio de transferência PS.
No cuvette, misture 30 microliters de suspensão liposesome lb e sonda FAPP NBD-PH com tampão HKM pré-aquecido para obter um volume final de 570 microliters. Uma vez alcançado o equilíbrio térmico da amostra, inicie a medição. Após um minuto, injete 30 microliters de suspensão liposama de LA.
Após três minutos, injete o LTP de interesse e regissou o sinal. Realize um segundo experimento para normalizar o sinal NBD. Misture 30 microliters de lb equilibrium lipossome suspensão com 250 nanomolar NBD-PH FAPP e 570 microliters de tampão HKM.
Após um minuto, injete 30 microliters de suspensão liposoma do equilíbrio la. Converta as curvas cinéticas para determinar a quantidade de PI(4)P transferido de lipossomos LB para LA ao longo do tempo e, em seguida, normalize cada ponto de dados. Para quantificar a extensão da qual um LTP é eficiente.
Realize uma regressão linear dos primeiros pontos de dados da cinética de transferência para obter uma inclinação. Divida o valor da inclinação pela concentração de LTP na mistura de reação para determinar o número de moléculas lipídicas transferidas por proteína por unidade de tempo. A recuperação eficiente do lact C2 das contas foi verificada com a análise de páginas da SDS.
O espectro absorvente visível ultravioleta de C2 lact rotulado com NBD confirmou que todas as moléculas de lact C2 foram rotuladas com um grupo NBD. A pureza do lact NBD-C2 e sua fluorescência foram determinadas pela análise de páginas da SDS. A fluorescência de NBD-C2 lact ou NBD-PH FAPP foi máxima quando apenas lipossomos contendo PS ou PI(4)P foram usados para incubação, indicando que o sensor estava ligado à membrana.
Uma baixa fluorescência foi observada quando Osh6p também estava presente indicando que essa proteína extraía PS ou PI(4)P eficientemente de lipossomos. Os resultados de um ensaio de transferência PS usando Osh6p como LTP são mostrados. As curvas cinéticas médias da transferência de PS de lipossomos de LA para lipossomos LB, dopadas ou não dopadas com fosfaticisitol-4-fosfato foram calculadas.
A taxa média inicial de transporte de PS foi determinada a partir de três experimentos distintos. Da mesma forma, os resultados de um ensaio de transferência PI(4)P usando Osh6p como LTP são mostrados aqui. Junto com as curvas cinéticas médias obtidas após a normalização do sinal.
As taxas médias de transferência foram medidas com lipossomos de LA que foram dopados ou não dopados com PS. Ao executar este protocolo use buffer fresco e prepare os mesmos dias. Minimize a exposição leve de lipossomos e proteínas florescentes, use proteína bem purificada rotulada de NBD e mantenha-as no gelo. pode ser confirmado medindo a transferência de PS e PI(4)P entre organela dentro da célula procariótica usando sensores lipídicos fluorescentes geneticamente codificados.
Essa técnica abre caminho para uma melhor compreensão da PS e pi(4) são distribuídas dentro da célula, e sua atividade sofre especificação de vários LTPS.
