This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

1. Preparação dos lipossomas e proteolipossomas <ol><li> Formação de lipossomas <ol><li> Usando uma seringa de vidro, adiciona 1435 ul POPC (25 mg / ml, em clorofórmio) e 160 ul POPG (25 mg / ml, em clorofórmio) para um balão de fundo redondo para se obter 52,5 umol lípidos numa razão molar de POPC: POPG = 9: 1. </li><li> Secam-se os lípidos para 30 min, utilizando um evaporador rotativo a uma velocidade de rotação de 145 rpm (sem banho de água é necessária para este volume de solvente), e depois transferir o frasco para um secador de vácuo durante pelo menos três horas, ou durante a noite, à temperatura ambiente (RT). </li><li> Hidratar a película de lípido seca com 10 ml de HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 100 mM (daqui em diante referido como tampão A) agitando suavemente o balão até uma homogéneos, resultados suspensão turva; NOTA: A concentração de lípido nesta fase deve ser de 5,25 mM como não há perdas deve ter ocorrido até agora. </li><li> Sonicar a suspensão num banho de água durante 10 min à temperatura ambiente com uma frequência óF 40 kHz. A solução vai olhar um pouco mais clara. </li><li> Usando um extrusor, passar a suspensão a 10 vezes através de uma membrana com um tamanho de poro de 400 nm, seguido de um segundo ciclo de extrusão com 4 passagens através de uma membrana com um tamanho de poro de 200 nm. NOTA: O diâmetro médio dos LUV resultantes é de ~ 175 nm. Se necessário, o tamanho e homogeneidade dos LUV podem ser verificados por dispersão de luz dinâmica de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Quantificar a concentração de fosfolípidos da suspensão LUV como descrito na secção 1.2). NOTA: Devido às perdas durante a extrusão, a concentração é geralmente cerca de 3,6 mM. </li><li> Armazenar os LUV a 4 ° C durante cerca de 2 semanas se não for usado imediatamente. </li></ol></li><li> Quantificação Phospholipid NOTA: Para determinar a concentração de fosfolípidos da suspensão LUV utilizada para a reconstituição, bem como a dos proteolipossomas que, eventualmente, são gerados, uma alíquota da amostra é subjected à oxidação pelo ácido perclórico. Este procedimento decompõe fosfolípidos para libertar fosfato inorgânico que é em seguida quantificado por um ensaio colorimétrico, em comparação com os padrões de 23. <ol><li> Prepara-se uma solução estoque de 40 mM de fosfato de sódio (Na 2 HPO 4) em água desionizada destilada. </li><li> Diluir a solução estoque com água destilada deionizada para obter 4 mM e 0,4 mM soluções que servirão como padrões de calibração de trabalho. </li><li> Usando as soluções de trabalho, preparar padrões em tubos de 13 x 100 mm 2 de vidro que vão de 0 a 80 nmoles de fosfato de sódio, num volume final de 50 ul. </li><li> Tomar 10 ul de cada uma das amostras e LUV proteolipossoma a serem quantificados e dilui-se com 40 jil de ddH2O em 13 tubos x 100 mm 2 de vidro. NOTA: Como a concentração de lípidos das LUV e proteolipossomas está na gama de 2,5-5 | iM, os 10 ul da amostra deve conter 25-50 nmol de lípido de fósforo.</li><li> Adiciona-se ácido perclórico a 300 ul a cada um dos padrões e amostras e calor durante 1 hora a 145 ° C num bloco de aquecimento. Colocar os tubos em berlindes para prevenir a evaporação. </li><li> Deixe os tubos arrefecer até à temperatura ambiente e adiciona-se 1 ml de ddH 2 O. </li><li> Adicionar 400 ul de cada recém-preparada de 12 g de molibdato de L / de amónio e 50 g / l de ascorbato de sódio e agitar com vortex para misturar. </li><li> Aquecer durante 10 min a 100 ° C com berlindes no topo dos tubos. Retire os tubos do bloco de aquecimento e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente. </li><li> Medir a absorção das amostras contra a (amostra padrão contendo fosfato de sódio 0 nmol) em branco com um espectrómetro, num comprimento de onda de 797 nm. </li><li> Determinar o teor de fosfato de amostras em relação à curva padrão de calibração. </li></ol></li><li> Reconstituição de Opsina NOTA: É necessário determinar as condições óptimas para a reconstituição de inchamento uma vez que estes dependem da natureza do detergente, bemcomo a composição de lípido e concentração das LUV. Como LUV alterar as suas propriedades de dispersão de luz no inchaço do processo pode ser monitorizada por medição da absorvência (Figura 2) como revisto por Rigaud e Levy 24 e Geertsma et ai. 25. <ol><li> Pipetar 800 l de LUV (a partir da Secção 1.1, tal como a recuperação de lípido após a extrusão é de 70%, a concentração esperada de LUV é fosfolípido 3,6 mM) num tubo de microcentrifugação de 2 ml. </li><li> Adicionar 5,3 mL de tampão A e 34,7 ul de 10% (w / v) DDM dissolvido em tampão A. </li><li> Incubar durante 3 h à temperatura ambiente com mistura-sobre-extremidade final. </li><li> Enquanto isso, prepare as esferas de poliestireno: <ol><li> Use 400 mg de contas por amostra e pesá-los para fora em um copo de vidro. </li><li> Lavar duas vezes com metanol, três vezes com água e uma vez com tampão A. Para cada utilização passo de lavagem de 5 ml de líquido e agita-se lentamente durante 10 min. NOTA: Recomenda-se a preparar o poliestirenogrânulos para várias amostras ao mesmo tempo, por exemplo, pesam em 6 g de pérolas e lava-se com 75 ml de líquido. grânulos excesso pode ser armazenado num frigorífico durante vários dias. </li></ol></li><li> Durante os últimos 30 min de desestabilização vesícula secar o fosfolípido NBD-rotulados num tubo com tampa de rosca de vidro ( &#39;reconstituição tubo de vidro&#39;): por exemplo, 9,5 ul de NBD-PC (1 mg / ml em clorofórmio, obtendo-se 0,4% em mol de fosfolípidos totais) são secas sob uma corrente de azoto num tubo de vidro e subsequentemente dissolvido em 45 ul de 0,1% (w / v) em tampão A. DDM </li><li> Após 3 h de desestabilização vesícula adicionar o fosfolipido Dissolveu-NBD-marcado, a proteína solubilizada e DDM-tampão A de tal modo que o volume final de 1 ml contém 0,36% (w / v), isto é, 7 mM, DDM. <ol><li> Assim, para gerar lipossomas livres de proteínas (utilizado como uma amostra de controlo) adicionar 45 ul de NBD-PC (dissolvidos em 0,1% de DDM), 60 ul de 0,1% de DDM e 55 ul de tampão A; para proteolipossomos acrescentar, para o examePLE, 40 ul de proteína (a partir de uma solução-mãe típica de ~ 110 ng / ul) em 0,1% de DDM, 45 ul de NBD-PC (dissolvidos em 0,1% de DDM), 20 ul de 0,1% de DDM e 55 ul de tampão A . NOTA: A ordem de adição deve ser conforme listado. </li></ol></li><li> Misturar a amostra para um fim horas adicionais sobre a extremidade, à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 80 mg de pérolas de poliestireno preparadas e incubar a amostra com a extremidade-sobre-extremidade mistura durante 1 h à TA. </li><li> Em seguida adicione um adicional de 160 mg de grânulos de poliestireno e incubar com ponta-a-ponta a mistura durante mais 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Transferir a amostra (deixando os grânulos de poliestireno passados ​​para trás) a um tubo de vidro com tampa de rosca contendo 160 mg de grânulos de poliestireno frescos e misturar durante a noite a 4 ° C. NOTA: A maneira mais fácil de transferir a amostra e evitar sugando grânulos é a utilização de uma pipeta de Pasteur, que é empurrada para a parte inferior do tubo de vidro com uma pequena pressão positiva. Uma vez que a ponta da pipeta é firmemente nofundo do tubo, em seguida, a amostra pode ser retirada facilmente, sem interferência a partir das esferas. </li><li> Na manhã seguinte, transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga sem carregar sobre contas e colocar no gelo na preparação para o ensaio da atividade scramblase. </li></ol></li></ol> 2. Ensaio de Actividade scramblase NOTA: A intensidade de fluorescência de lipossomas ou proteolipossomas diluídas com tampão A é monitorizada ao longo do tempo após a adição de ditionito num espectrómetro de fluorescência. Para se obter uma intensidade de partida estável, a fluorescência é registada por pelo menos 50 segundos (ou até que um sinal estável é alcançada) antes de adicionar ditionito a uma amostra constantemente agitada e é, então, seguido por, pelo menos, 500 segundos após a adição de ditionito. <ol><li> Adicionar 1,950 mL de tampão A a uma tina de plástico contendo um mini-barra de agitação. </li><li> Adicionar 50 ul da Proteo preparada (lipossomas) e deixar equilibrar a amostra no espectrofotómetro de fluorescênciamedidor com agitação constante durante vários segundos. </li><li> Enquanto isso preparar uma solução de 1 M de ditionito em Tris 0,5 M não tamponada (por exemplo, para duas amostras pesam-se 20 mg de ditionito num tubo de microcentrifugação e dissolve-se em 114 mL de gelo frio de Tris 0,5 M directamente antes da utilização e manter em gelo para o próximo amostra). NOTA: A solução de ditionito deve ser preparada imediatamente e não deve ser usado mais de 20 minutos após a preparação; Se muitas medições estão a ser feitas, alíquotas de ditionito pode ser pesado com antecedência e dissolveu-se imediatamente antes da utilização. </li><li> Iniciar a monitorização da fluorescência (excitação 470 nm, emissão a 530 nm, fenda de largura de 0,5 nM). </li><li> Adicionar 40 ul da solução de ditionito de 1 M para a cuvete 50 segundos depois de começar a gravação de fluorescência (use o septo na tampa da câmara de cuvete se possível) e continuar a gravar a fluorescência para um outro 400-600 seg. </li><li> Analisar os dados conforme descrito na seção 3. </li></ol> 3.Análise de dados <ol><li> Cinética de Scrambling <ol><li> Caracterizar o rastreio de fluorescência de cada amostra obtida pelo ensaio de actividade scramblase definindo a fluorescência inicial, F I, antes de se adicionar ditionito, e a fluorescência de ponto final, F, alcançado após&gt; 400 seg. F i é determinada para cada amostra como o valor médio de fluorescência para o período de 30 segundos antes da adição de ditionito. </li><li> Determinar os dados de ponto de extremidade correspondente à extensão da redução da fluorescência, R = 100 • F / F i. Usamos os termos R L para os lipossomas livres de proteínas e R P para proteolipossomas contendo opsina. </li></ol></li><li> Determinação do peso molecular do Funcionalmente reconstituído scramblase <ol><li> Converter os dados de redução de fluorescência de acordo com a seguinte equação: P (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (Rmax - R L) (Equação 1) NOTA: Onde Rmax é a redução máxima que é obtida quando a proteína suficiente é reconstituído de modo a que todas as vesículas na amostra possuem pelo menos um scramblase funcional, e P é a probabilidade de que uma vesícula particular numa amostra reconstituída é &#39;scramblase-activo &quot;, isto é, que possui pelo menos um scramblase funcional. O valor de R L é tipicamente 45% 3 enquanto que Rmax é tipicamente 82,5% 3, em vez do esperado 100% (R máx pode ser determinada experimentalmente para proteolipossomas opsina com um PPR de&gt; 1 mg / mmol). Como Rmax &lt;100%, presume-se que uma sub-população de vesículas é refractário à reconstituição. Por R max = 82,5%, a fração de vesículas que é incapaz de aceitar a proteína é de 0,35. </li><li> Descrever a relação entre P (≥1 scramblase) e PPR (mg de proteína / fosfolípido mmol) por estatística de Poisson da seguinte forma: P (≥1 scramblase) = 1 - e <sup&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (equação 2) NOTA: em que m = número de scramblases por vesícula e α = constante ajuste de mono-exponencial em unidades de mg de proteína fosfolípido / mmol. </li><li> Como uma fracção das vesículas não contribui para a cifragem mesmo em alta PPR (ver discussão), modificar a equação: P (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equação 3) NOTA: Se PPR * = PPR / (1- f), em que f é a população de vesículas ou refractário, neste caso, PPR * = PPR / 0,65 (Equação 4). NOTA: O α constante ajuste é determinada ajustando um gráfico de p (≥1 scramblase) versus PPR * com uma função mono-exponencial. Se opsina (peso molecular 41,7 kDa) reconstitui funcionalmente em vesículas de 175 nm de diâmetro (cada vesícula tem 280.000 fosfolipídios 26) como um monômero, a = 0,187 mg mmol -1. Se opsina dimeriza antes da reconstituição 3, para se obter vesículas scramblase-activo, em seguida, α= 0,37 mg mmol -1. Se em vez de PPR PPR * estavam a ser utilizados para a análise, em seguida, os valores correspondentes ct seria 0,122 e 0,244 mg mmol -1. Estes valores previstos para α assumir que todas as moléculas opsina são funcionalmente competente. Se apenas uma fracção das moléculas é competente para embaralhar lípidos, em seguida, os valores correspondentes de α será maior. </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+purification,+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2,+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes.">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li><li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport.">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li><li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter.">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li><li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p,+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast.">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O ensaio de atividade scramblase permitiu-nos inicialmente para determinar que opsina tem actividade scramblase 2. O ensaio também permitiu-nos caracterizar a actividade scramblase de opsina por meio de testes de especificidade (foi utilizada uma variedade de lípidos repórter NBD-rotulados como NBD-fosfatidiletanolamina, marcado com NBD em uma cadeia de acilo, tal como mostrado para NBD-PC na Figura 1A, ou na headgroup, NBD-esf ingomielina ou NBD- fosfatidilserina 2), o efeito d...

A rodopsina dos fotorreceptores, um receptor acoplado a proteína G prototípico (revisto por exemplo, na referência 1), é a primeira scramblase a ser identificado e bioquimicamente verificada 2,3. Scramblases são transportadores de fosfolipídios que aumentam a taxa intrinsecamente lenta de transbilayer movimento fosfolipídios para fisiologicamente níveis apropriados em um bidirecional, forma ATP-independente 4-6. Exemplos de as suas acções podem ser encontradas no retículo endoplasmático e na membrana citoplasmática de bactérias, onde constitutiva de cifragem é necessária para a homeostase da membrana e crescimento, bem como para uma variedade de vias de glicosilação 5. Fosfolípido scrambling regulada é necessária para expor a fosfatidilserina (PS) sobre a superfície de células apoptóticas, onde actua como um &quot;comer-me&quot; -signal para macrófagos 7 e proporciona uma superfície de pró-coagulante nas plaquetas sanguíneas activadas para catalisar a produção do factor de proteínass necessário para a coagulação do sangue. Em membranas de discos fotorreceptoras, actividade de cifragem de rodopsina foi sugerido para compensar o desequilíbrio de fosfolípido entre os dois folhetos da membrana de bicamada que é gerado pelo ATP-dependente, lípido unidireccional flipase ABCA4 4,8,9 10-12. Apesar da importância fisiológica da scramblases, a sua identidade permanecido elusivos até rodopsina foi reportado como um scramblase em discos fotorreceptoras 2, membros da família de proteínas TMEM16 foram identificados como de Ca2 + dependentes de scramblases necessários para a exposição de PS na membrana plasmática (revisto em referência 13), e a proteína bacteriana FTSW foi proposto como um lípido II scramblase necessária para a síntese do peptidoglicano 14. Estas descobertas basearam-se na reconstituição de proteínas purificadas em lipossomas e demonstração de actividade scramblase nas proteolipossomas resultante utilizando a metodologia described aqui. Outros potenciais scramblases 15-21 - as proteínas MurJ e AMJ implicados na biossíntese dos peptidoglicanos, WzxE e proteínas relacionadas implicada na cifragem precursores de O-antigénio, proteína MprF necessário para translocar fosfatidilglicerol aminoacilado através da membrana citoplasmática de bactérias, e membros da família Xkr8 que têm sido propostos para expor PS na superfície de células apoptóticas - continuam a ser testado bioquimicamente. Isso destaca a importância de um ensaio robusto para identificar e caracterizar a atividade scramblase. Aqui, nós descrevemos a reconstituição de opsina purificada, a apoproteína da rodopsina de fotorreceptores, em vesículas unilamelares grandes (LUV), e a análise subsequente da actividade de scramblase nas proteolipossomas resultantes usando um ensaio baseado em fluorescência. Existem vários protocolos descritos poços disponíveis na literatura para a expressão heteróloga e purificação de opsina, portanto, não serádescrevê-lo neste protocolo; usamos os protocolos descritos em Goren et ai. 3 que produz FLAG-tag, opsina termoestável a cerca de 100 ng / ul em 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM). A reconstituição é conseguida por tratamento com LUV detergente suficiente para que elas incham mas não se dissolvem. Sob estas condições, uma proteína de membrana - fornecido na forma de micelas de detergente-proteína - irá integrar-se os lipossomas e tornar-se reconstituída para a membrana do lipossoma após a remoção de detergente, resultando em proteolipossomas. Para reconstituir opsina (obtido na forma de uma proteína purificada em 0,1% (w / v) DDM), LUV são preparados a partir de uma mistura de POPC (1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfocolina) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3- [fosfo-rac- (1-glicerol)]) e saturou-se com DCM antes de adicionar opsina e NBD-PC. O detergente é então removido por tratamento da amostra com contas de poliestireno. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; O princípio subjacente ao ensaio baseado em fluorescência é mostrado na Figura 1B. LUV são simetricamente reconstituída com uma quantidade vestigial de NBD-PC ou outro fosfolípido repórter fluorescente NBD-rotulado (Figura 1A). Por adição de ditionito, um dianião de membrana-impermeabilizante, moléculas de NBD-PC na monocamada externa dos LUV são tornadas não-fluorescente como a nitro-grupo de NBD é reduzido a um grupo amino não-fluorescente. Como nem moléculas NBD-PC nem ditionito são capazes de atravessar a membrana sobre a escala de tempo da experiência (&lt;10 minutos), o que resulta em redução de 50% do sinal de fluorescência. No entanto, se os lipossomas são reconstituídos com uma scramblase, moléculas de NBD-PC no folheto interno pode precipitação rapidamente para o exterior, onde eles são reduzidos. Isso resulta na perda total de fluorescência, no caso ideal (Figura 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Representação esquemática do ensaio de actividade scramblase O ensaio utiliza um repórter lípido marcado com NBD fluorescente; NBD-PC é mostrado (A). As grandes vesículas unilamelares são reconstituídos com uma quantidade vestigial de NBD-PC. Reconstituição produz vesículas simétricas, com NBD-PC distribuído igualmente nos folhetos exteriores e interiores. Ditionito de (S 2 O 4 2-) quimicamente reduz o grupo nitro de NBD para um grupo amino não-fluorescente. Tratamento de lipossomas livres de proteínas com ditionito (B, parte superior) provoca uma redução de 50% da fluorescência uma vez que apenas as moléculas de NBD-PC na monocamada externa são reduzidas: ditionito é carregada negativamente e não pode atravessar a membrana para reagir com as moléculas de NBD-PC no folheto interno. Tratamento ditionito de proteolipossomas contendo opsina (B, parte inferior), isto é, proteolipossomas scramblase-activo, resulta em perda de 100% do Fluorescence como opsina facilita o movimento de NBD-PC entre o interior e o folheto externo. (C) mostra vestígios de fluorescência obtidos idealizadas no tratamento de lipossomas livres de proteínas e proteolipossomas contendo opsina com ditionito. A taxa de perda de fluorescência é o mesmo em ambos os casos, indicando que a redução química de NBD por ditionito é limitante da taxa, e que o embaralhamento ocorre a uma velocidade igual ou maior do que a velocidade da reacção química. Traços obtidos a partir de um experimento real são mostrados na Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Os métodos que descrevem pode ser utilizado para a reconstituição e ensaio de outras proteínas purificadas, bem como misturas de proteínas de membrana obtida, por exemplo, por extracção com detergente 22 microssomas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1148">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:141px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:132px;">850457C</td>
			<td style="width:193px;">POPC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457C</td>
			<td>POPG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810130C</td>
			<td>NBD-PC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EM-5330</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dodecyl-&#946;-d-maltoside&#160;</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310 5 GM</td>
			<td>DDM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorimeter cuvettes</td>
			<td>sigma</td>
			<td>C0918-100EA</td>
			<td>cuvettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrofluorometer</td>
			<td colspan="2">Photon Technology International, Inc.</td>
			<td>fluorimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrosulfite technical grade, 85%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>157953-5G</td>
			<td>dithionite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 5 software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prism</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JTX171-3</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIPEX 10 mL extruder&#160;</td>
			<td>Northern Lipids, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Extruder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman, Drain disc, PE, 25 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">28156-243</td>
			<td>Disc support</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110607</td>
			<td>400 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110606</td>
			<td>200 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13x100 mm</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perchloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30755-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7302</td>
			<td>ammonium molybdate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631-25G</td>
			<td>sodium ascorbate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Beads SM2 adsorbents</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td>polystyrene beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;2.0 mL Microtubes clear</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10011-742</td>
			<td>Reconstitution tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reconstitution glass tube</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td style="width:132px;">53283-800</td>
			<td>Reconstitution glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer&#160;</td>
			<td>Malvern&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DLS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity

Scramblases fosfolípidos translocar através da bicamada de membrana bidireccionalmente de uma forma independente de ATP. A primeira a ser identificada scramblase bioquimicamente e verificou-se opsina, a apoproteína da rodopsina dos fotorreceptores. A rodopsina é um receptor acoplado a proteína G localizado em membranas de discos haste fotorreceptoras da retina, onde é responsável pela percepção da luz. Atividade scramblase da rodopsina não depende do seu ligando 11- cis-retinal, ou seja, a opsina apoproteína também atua como um scramblase. Embora fosfolípido constitutiva e regulada scrambling desempenhar um papel importante na fisiologia da célula, apenas alguns scramblases de fosfolípidos foram identificados até agora, além de opsina. Descrevemos aqui um ensaio baseado em fluorescência de actividade scramblase de opsina. Opsina é reconstituído em grandes lipossomas unilamelares compostos por fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol e uma quantidade traço de fluorescente marcado com NBD PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoil} - sn-glicero-3-fosfocolina). scramblase actividade é determinada medindo a extensão em que as moléculas de NBD-PC localizados no folheto interno da vesícula é capaz de aceder ao folheto exterior, onde a sua fluorescência é eliminado quimicamente por um agente de redução que não pode atravessar a membrana. Os métodos que descrevem têm aplicabilidade geral e podem ser utilizados para identificar e caracterizar as actividades scramblase de outras proteínas de membrana.

Descreve-se a reconstituição de opsina em LUV para caracterizar a sua actividade scramblase usando um ensaio baseado em fluorescência. Analisamos os resultados para colocar um limite inferior na taxa de fosfolípido mediada por opsina cifragem e para determinar o estado oligomérico em que opsina reconstitui funcionalmente para as vesículas. Para identificar as condições óptimas de reconstituição, é necessário deter...

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A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.8K visualizações.  Weill Cornell Medical College. We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin. 

Vídeo: A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Bioquímica

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

Caracterização de baseada em fluorescência rápida das vesículas extracelulares única no sangue humano, com análise de acompanhamento de nanopartículas

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Um ensaio de clivagem de peptídeo Fluorogenic para triagem de atividade proteolítica: aplicações para coronavirus spike ativação de proteína

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.

Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Enriquecimento de uma única etapa de um histone TAP-Tagged deacetilase do fungo filamentoso Aspergillus nidulans para o ensaio de atividade enzimática

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...