Um ensaio robusto de leitor de placas como o nosso é muito útil para a triagem inicial de potenciais inibidores da metiltransferase. A capacidade de coletar dados em tempo real é uma grande vantagem do ensaio contínuo acoplado à endonuclease. Comece preparando 600 microlitros das condições do ensaio contendo 20 compostos micromolares e 50 micromolares separadamente nos tubos de microcentrífuga no gelo.
Para fazer isso, adicione água destilada dupla e tampão de metilação 5X a cada tubo para atingir uma concentração final de tampão de metilação 1X. Em seguida, adicione 3,15 microlitros de 20 miligramas por mililitro de albumina sérica bovina, ou BSA, a cada amostra. Em seguida, adicione dois microlitros de 3,15 substrato micromolar de DNA hairpin e 1,33 microlitros de 4,75 micromolares S-adenosilmetionina, ou SAM, a cada amostra.
Adicionar inibidor às amostras adequadas para atingir uma concentração final de 21 micromolares ou 52,5 micromolares e uma quantidade equivalente de sulfóxido de dimetilo, ou DMSO, a uma amostra de controlo antes de misturar as soluções por vórtice a 3 000 rotações por minuto durante três segundos. Em seguida, gire as amostras por alguns segundos em uma minicentrífuga de mesa a 1, 200 vezes G para garantir que a solução seja coletada na parte inferior do tubo. Aliquot 95 microlitros de cada solução de ensaio em seis poços consecutivos em uma placa preta de 96 poços de meia área.
Preparar 75 microlitros de solução enzimática Gla I ou DNMT1 mais Gla I nos tubos de microcentrífuga, conforme descrito anteriormente, até uma concentração final de tampão único. Em seguida, adicione 1,2 microlitros de 10 unidades por microlitro Gla I a cada solução para atingir uma concentração final de 0,16 unidades por microlitro. Adicionar 0,6 microlitros de cinco micromolares com DNMT1 sem RFTS à solução DNMT1 mais Gla I para uma concentração final de 40 nanomolares.
Após uma mistura suave, gire as amostras por alguns segundos em uma minicentrífuga de mesa a 1.200 G para garantir que a solução seja coletada na parte inferior do tubo. Em seguida, alíquota de 12 microlitros de cada solução enzimática em seis poços em uma placa de 96 poços de fundo cônico. Para o ensaio de metilação da amostra de DNA, pré-aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius.
Em seguida, insira a placa preta que contém as soluções de ensaio no leitor de placas. Depois de agitar a placa a 425 CPM, meça a fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 528 nanômetros. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Remova a placa de ensaio do leitor de placas e adicione cinco microlitros da solução enzimática a cada poço, seguido de misturar a solução por pipetagem para cima e para baixo. Insira a placa no leitor de placas e agite a placa antes de registrar a fluorescência a cada 53 segundos por 30 minutos. Obter a fluorescência média dos ensaios de controle de Gla I triplicado para cada condição e subtrair a média de Gla I contendo bandejas de reação de controle dos traços triplicados obtidos na presença de DNMT1 sem RFTS.
Em seguida, determine o erro médio e padrão da média para as replicações corrigidas. Plote o traço médio de reação corrigida e ajuste a porção linear inicial a uma linha para determinar a velocidade inicial. Determine a porcentagem de atividade dividindo a velocidade observada na presença de um composto pela velocidade observada no DMSO contendo reação de controle e multiplicando por 100.
Os resultados de um ensaio descontínuo acoplado à endonuclease mostraram que o DNA do produto totalmente metilado é protegido da clivagem, confirmando que o DNMT1 sem RFTS é ativo e capaz de metilar o DNA do substrato hemimetilado. No ensaio baseado em fluorescência, na ausência de Gla I, a adição de DNMT1 ou tampão isoladamente não afetou a fluorescência de fundo. A adição subsequente de Gla I a todos os ensaios resultou na geração de fluorescência apenas em ensaios que continham DNMT1.
A adição simultânea de DNMT1 e Gla I sem RFTS a três ensaios resultou em geração de fluorescência robusta. A adição de Gla I sozinha não produziu fluorescência. Para rastrear potenciais inibidores, a atividade de metilação do DNA do DNMT1 sem RFTS foi examinada na presença de DMSO, composto um, composto dois ou composto três em concentrações de 20 e 50 micromolares.
Os compostos que reduzem a geração de fluorescência neste ensaio acoplado devem ser validados ainda mais. Garantir que os compostos não estejam inibindo a enzima de acoplamento é um próximo passo importante.
