Este método aborda um problema comum no campo e fornece um fluxo de trabalho completo para isolamento rápido e caracterização de vesículas extracelulares únicas com marcadores específicos de interesse. A análise de rastreamento de nanopartículas é um método semi-automatizado. Utiliza as propriedades de dispersão de luz e movimento browniano para analisar a distribuição de tamanho de vesículas extracelulares.
Demonstrando o procedimento será Vera Schmidt, uma estudante de doutorado do nosso laboratório. Para isolar as vesículas extracelulares, depois de coletar duas amostras mililitros de sangue humano inteiro em tubos de separação de soro, permitem que as amostras coagulam por 15 minutos à temperatura ambiente antes de separar as células do soro por centrifugação. Transfira um mililitro de soro de cada amostra para tubos de reação individuais de 1,5 mililitro para centrifugação para remover as plaquetas, e transfira 100 microliters do plasma pobre em plaquetas para novos tubos de reação de 1,5 mililitro.
Em seguida, adicione 25 microliters de solução de precipitação exosoma ao plasma e vórtice das amostras completamente. Após uma incubação de 30 minutos no gelo, colete as vesículas extracelulares por centrifugação. A pelota aparecerá como uma cor bege ou branca.
Aspire o supernatante e centrifugar a amostra novamente. Em seguida, remova todos os transes de fluido e resuspenja a pelota em 100 microliters de PBS. Para colorir as membranas celulares das vesículas, adicione 10 microliters da suspensão EV a 50 microliters de solução de corante abólica PKH67 recém-preparada e misture bem.
Após cinco minutos à temperatura ambiente no escuro, diluir 50 microliters da suspensão de vesícula extracelular manchada com 2,5 mililitros de água destilada em um tubo cônico de 15 mililitros, com mistura completa. Para rotular as vesículas com anticorpos, diluir de 10 a 20 microlitadores da suspensão vesícula extracelular não localizada com 50 microliters de água destilada em um tubo de reação de 1,5 mililitro, com mistura completa. Adicione 2,5 a cinco microliters do anticorpo de interesse ao tubo de reação, com mistura completa, para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
Em seguida, transfira 50 microliters das vesículas rotuladas para um tubo cônico de 15 mililitros contendo o volume experimental adequado de água destilada, com mistura completa, conforme indicado na tabela. Antes de analisar as vesículas extracelulares manchadas ou rotuladas, primeiro mova o filtro de fluorescência para o caminho óptico do microscópio e da câmera, e inicie o programa, seguindo as instruções na tela para implementação automatizada. Na guia Verificação celular, selecione o número de célula correto para medição de fluorescência e a posição de referência para a óptica, para confirmar que o laser e o microscópio estão em um foco comum.
Use uma seringa para lavar o canal celular com 10 mililitros de água destilada, tomando cuidado para que a célula de medição esteja livre de bolhas de ar e que as bolhas de ar não sejam injetadas no sistema. Em seguida, diluir 10 microlitres de partículas de poliestireno de 200 nanômetros com rótulo de fluorescência em 990 microliters de água destilada e adicionar 10 microlitres desta suspensão de partículas em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de água destilada. Em seguida, injete 2,5 mililitros da primeira solução de partículas diluídas no canal da célula e clique em Otimizar o Foco para ajustar a câmera.
Para medir a amostra, lave o canal celular várias vezes com 10 mililitros de água destilada e injete a suspensão de vesícula extracelular manchada. Utilizando a posição de referência, ajuste os parâmetros de aquisição apropriados sob a guia Verificação de células, conforme indicado na tabela. Para identificar o intervalo de sensibilidade ideal, clique em Número de Partículas vs.
Sensibilidade, para exibir uma curva das partículas medidas por tela para os diferentes níveis de sensibilidade. Para o parâmetro obturador, ajuste o período de tempo que a câmera permite que a luz passe por um intervalo determinado. Para os Parâmetros pós-aquisição, selecione um brilho mínimo de 20, um tamanho mínimo de 20 nanômetros e um tamanho máximo de medição de 500 nanômetros.
Observe o número de partículas detectadas no campo de visão do display. A barra de dispersão deve ser no verde para laranja, 50 a 300 partículas de alcance. Clique em Verificar deriva de partículas em Zero Volts e abra a guia Medição.
Clique em Executar a aquisição de vídeo e defina o número de experimentos para três a cinco, e o atraso de tempo entre os experimentos para zero minutos. Defina o número de posições individuais de subvolume para 11 e o número de ciclos de medição para 10 em cada posição de medição na qual as partículas devem ser analisadas. Em seguida, selecione uma pasta, crie um novo nome de arquivo e clique em "Ok" para iniciar a medição.
Ao final da análise, abra a guia Análise para revisar os resultados. Em seguida, verifique o número médio de partículas por posição, o número total de partículas rastreadas e a concentração de partículas, a largura de distribuição das partículas, e o valor da média, e o desvio padrão. O uso de contas fluorescentes para o ajuste e calibração da medição dá uma sensibilidade de ajuste ideal de 85% Utilizando essas configurações, a câmera exibe uma imagem nítida e as medidas repetidas demonstram um baixo desvio padrão.
A coloração com um kit de ligadores celulares que inclui um linker celular fluorescente que incorpora um corante fluorescente verde com caudas longas e alifáticas em regiões lipídicas da membrana celular, revela uma forte correlação entre a sensibilidade e o número de partículas medidas. Anticorpo de coloração de vesícula extracelular contra uma proteína de interesse indica uma distribuição de partículas de 220 a 1.145 nanômetros, com um pico máximo de 541 nanômetros. Não são detectadas vesículas extracelulares após a coloração de anticorpos da água livre de vesículas de controle, até uma sensibilidade próxima a 100%Se a medição for iniciada quando a deriva for superior a 5 micrômetros por segundo, as repetições individuais demonstram desvios distintos.
É importante notar que o uso de isothiocyanato fluoresceína como fluorocromo resulta em medidas imprecisas e irreproducentes, já que este fluorforeiro é propenso a fotobleaching rápido. Este protocolo atende à demanda líder de muitos pesquisadores neste campo para uma caracterização rápida de vesículas extracelulares únicas, utilizando marcadores específicos. Apesar de, na última década, os métodos terem melhorado consideravelmente, ainda não há um protocolo padronizado para análise de vesículas extracelulares únicas.
Independentemente do progresso futuro da pesquisa sobre biologia vesícula extracelular, este método fornece um protocolo rápido e confiável para caracterização de vesículas extracelulares únicas usando marcadores específicos. Como nossos protocolos atuais não envolvem longos tempos de processamento ou etapas intensivas em mão-de-obra, eles também são adequados para um alto rendimento amostral.
