Aqui apresentamos protocolos aprimorados para preparar amostras crio-EM com filmes de suporte usando um novo bloco de flutuação que facilita o manuseio de filmes tão delicados. A principal vantagem deste método é que a amostra é protegida da interface da água do ar onde podem ocorrer efeitos nocivos como a desnaturação. Um dos protocolos aqui apresentados evita qualquer tipo de tratamento caro para tornar o gráfico hidrofílico, aumentando assim sua acessibilidade a toda a comunidade EM.
Pequenos dispositivos de flutuação ainda não são amplamente utilizados pela microscopia eletro para uma boa preparação. Assim, essas demonstrações visuais podem fornecer uma referência para seu uso. Para começar, lave as grades TEM com água destilada dupla e acetato de enguia seguido de limpeza de plasma.
Em seguida, adicione 10 a 12 microliters da amostra no poço de troca de buffer, o bloco de flutuação e 10 a 12 microliters de solução de acetato 2% urinário na troca não tampão adjacente bem para coloração negativa. É essencial tomar as precauções de segurança adequadas ao trabalhar com a mancha. Corte cuidadosamente dois pequenos pedaços de mica com filme de carbono pré-colocado no topo.
Certifique-se de que os fragmentos de mica são largos o suficiente para caber no poço e mais longo do que o comprimento do poço, de tal forma que o fragmento pode sentar-se sobre o poço enquanto o carbono está flutuando e há espaço suficiente para lidar com o fragmento com a pinça. Mergulhe o mica no poço com um ângulo aproximado de 45 graus até que o mica se sente na rampa do poço e a camada de carbono seja observada na superfície da amostra líquida. Depois de incubar o carbono com a amostra, retire a folha de mica muito lentamente para recuperar o filme de carbono e minimizar a retenção residual da amostra de vísco.
Limpe cuidadosamente o mica tocando a superfície inferior não-carbono com um papel filtro para remover o excesso de líquido e imergir o fragmento de mica no poço oposto contendo solução de acetato 2% urinária para trocar a camada de carbono com a mancha negativa. Recupere a camada de carbono flutuante com o lado sagrado coberto de carbono da rede EM lavada e limpa de plasma. Em seguida, deixe as grades secarem até que a imagem esteja no TEM, de preferência cobrindo-as para evitar contaminação no ar.
Depois de limpar as grades TEM como demonstrado anteriormente, prepare a suspensão do óxido de grafeno pouco antes do uso e o vórtice completamente. Em seguida, adicione 10 a 12 microliters de suspensão de óxido de grafeno nos quatro poços de troca de buffer. ao longo do bloco de flutuação.
Adicione 10 a 12 microliters de água dupla destilada ou água ultra pura nos quatro poços de troca de buffer restantes do bloco. Solte quatro grades suavemente sobre a suspensão de óxido de grafeno de cada poço e incubar por um minuto para garantir que o lado sagrado coberto de carbono esteja em contato com a solução. Após um minuto, recupere cada grade cuidadosamente deslizando as pinças para o sulco da pinça de cada poço de troca de não tampão.
Empurre suavemente e brevemente o lado coberto de cobre não-carbono de cada rede com a água dupla destilada no poço adjacente até que a gota de água seja visível na rede. Em seguida, segure cuidadosamente a gota d'água da rede de cabeça para baixo contra um pedaço de papel filtro. Cubra as grades e deixe-as na pinça para secar o ar.
Coloque quatro grades de lavagem em cima de uma folha de grafia de cobre depositada em um slide de vidro, e cubra cada grade com uma gota de isopropanol para permitir contato íntimo entre o grafeno monocamado e a grade. Após a evaporação completa do isopropanol, flutue a folha de grafeno de cobre com grades sobre a solução de cloreto férrico na placa de petri de vidro. Em seguida, cubra o prato para evitar contaminação no ar e deixe-o gravado à temperatura ambiente durante a noite.
Use um laço com o diâmetro maior que o tamanho da grade TEM para pescar as grades flutuando na monocamada de grafeno e transfira-as cuidadosamente para uma placa de vidro petri contendo água dupla destilada para lavagem. Lave as grades duas vezes na água e transfira as grades para uma placa de Petri contendo tampão de amostra até a preparação da amostra e o congelamento do mergulho. Adicione 10 a 12 microliters da amostra em um poço do bloco de flutuação.
Quando a amostra estiver pronta no bloco, escolha a grade revestida de grafeno da solução tampão usando um par de pinças limpas e coloque-a sobre a superfície da amostra que contém bem. Após um período de incubação apropriado, pegue a grade com um par de pinças limpas de congelamento e proceda com manchas e vitrificação. Grades manchadas negativamente preparadas com o bloco de flutuação de suporte são tipicamente cobertas com carbono amorfo em toda a superfície da rede.
Embora a quebra da película de carbono ocorra em alguns casos, um grande número de quadrados de grade são imaculados e, portanto, aplicáveis para fins de coloração negativa. Da mesma forma, uma boa cobertura cinematográfica é rotineiramente alcançada em toda a grade usando o protocolo de óxido de grafeno. As redes de óxido de grafeno podem ser preparadas rapidamente a partir de matérias-primas e são altamente protetoras da amostra.
Manter o grafeno molhado e a aplicação da amostra in situ pouco antes de congelar é suficiente para gerar camadas de gelo adequadas para crio-EM. Este protocolo não requer equipamentos para tornar o hidrofílico de grafeno e fornece uma vantagem para a recuperação da amostra. O bloco de flutuação de suporte tem duas portas de agulha no local de cada poço que permitem estender o buffer em C2, o que é muito útil para amostras derivadas de gradientes de glicerol.
O bloco de flutuação permitiu a exploração de métodos de purificação de afinidade na grade utilizando o fluxo de buffer controlável de pequenos volumes, bem como filmes de suporte funcionalizados.
