Name: a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Agradecemos sinceramente Shigeo Kita, por suas valiosas sugestões e discussão. Agradecemos também a John e Sumire Eckstein para sua leitura crítica do manuscrito.

Nota: As amostras utilizadas neste estudo foram microorganismos, rapidamente congelados com propano em nitrogênio líquido, congelam substituídos em acetona contendo 2% de tetróxido de ósmio e incorporado em epóxi resina1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. preparação do filme de apoio (Figura 1-3)
Nota: Filme de suporte prateado Formvar é preparado usando o método de molde-em-vidro19.
<ol><li>Adicionar 100 mL de 1,5% Formvar no dicloreto de etileno, para um aparelho de fabricação de Formvar (Figura 1). Mergulhe metade de uma lâmina de vidro (76 x 26 x 1,3 mm) em solução de Formvar na coluna superior do aparelho, pressionando a solução com o ar através de 'um' usando uma bola de borracha19.<ol>
<li>Drene a solução da coluna abrindo a torneira de três vias e liberando o ar através de 'b' para reduzir a pressão. Retire a lâmina de vidro do aparelho e seco no ar para formar uma película na superfície do vidro slide. Use uma lâmpada de incandescência para acelerar a secagem do filme Formvar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de raspar as quatro bordas do filme sobre a lâmina de vidro com uma lâmina de barbear (Figura 2a) e respirando para o slide para facilitar a separação do filme do slide20, flutuam o filme na água por imersão da lâmina de vidro para o água lentamente em um ângulo horizontal baixo (cerca de 10°, Figura 2b).</li>
	<li>Colher-se o filme de Formvar da água usando um rack de alumínio (30 x 25 x 3 mm) com furos (4 mm de diâmetro) (Figura 3a). Manter o rack com o filme de Formvar num exsicador até à utilização (Figura 3b).</li>
</ol>2. corte o bloco de amostra com uma lâmina de corte ultra-sônico e uma lâmina de barbear 21 sob um estereomicroscópio (Figura 4)
<ol><li>Certifique-se de que existem células na superfície do bloco, observando a ponta do bloco com um microscópio de luz (figura 4a).</li>
	<li>O bloco de amostra no mandril (suporte de bloco) e montagem do mandril em um palco de aparamento21 (figura 4b). Nesta fase de aparamento tem um mecanismo de iluminação na parte de trás do espécime.</li>
	<li>Apare o bloco para um tamanho de 0,7 x 1,0 mm (figuras 4C, 5D). Uma vez que a resina epóxi é muito difícil, apare os blocos primeiro usando uma lâmina de corte ultra-sônico. A lâmina de corte ultra-sônico é uma máquina recém introduzida, e os blocos são facilmente cortados. Então corte o bloco ainda mais com uma lâmina de barbear. Corte um ombro para marcar a direção de corte (consulte a Figura 5 d, Figura 8).</li>
</ol>3. corte o bloco de amostra com faca de diamante usando o micrótomo (Figura 5)
<ol><li>Defina o bloco de amostra chuck no porta-amostra do ultramicrotome. Coloque o espécime 90° no sentido anti-horário contra a posição real quando ultrafinos de seccionamento serial é realizada (ver Figura 5D).</li>
	<li>A superfície do bloco de corte com uma faca de corte de diamante (ver Figura 5 d). Definir a navalha de diamante paralelas na face do bloco de amostra e corte a quantidade mínima da superfície de amostra para não perder qualquer espécime (Figura 5D). Nota: Este passo é feito para suavizar a superfície da amostra. A parte da superfície do espécime da parte magro permanece intacta (por conseguinte, esta parte não brilha como um espelho, Figura 5D), para não perder nenhuma parte da amostra para seccionamento serial. Isto é porque o espécime é exposto na superfície do bloco.</li>
	<li>Coloque um espelho (corte de Mesa, M) no palco faca para monitorar o corte do bloco de amostra (Figura 5C).</li>
	<li>Corte a borda esquerda (isso se torna o lado superior, Figura 5D, da amostra no seccionamento serial) do bloco usando faca de aparar girando o palco faca 30 ° para a esquerda (Figura 5a).</li>
	<li>Corte o rosto de bloco em cerca de 100 µm da borda esquerda da amostra (este torna-se o lado inferior da amostra no seccionamento serial, Figura 5D), rodando o palco faca 30 ° para a direita (Figura 5b). Nota: As seções seriais serão cortadas da parte magro da amostra de cerca de 90 nm x cerca de 1 mm de tamanho. A grande parte será usada para ajustar a superfície da amostra e a navalha, tal que eles são paralelos. Depois de ajustar a superfície do espécime para ser paralela à borda da faca, o grande parte será removida com uma lâmina de barbear. Cortando os lados superiores e inferiores da amostra usando o micrótomo, ambos os lados da amostra se tornar suave e exatamente paralelos uns aos outros (Figura 5D), que é necessário para obter as seções de fita reta e ininterrupta.</li>
</ol>4. ajustar a borda de superfície e faca de espécime para que eles enfrentam paralelo a outro 21
<ol><li>Remover a faca de corte e rodar o bloco de amostra 90° no sentido horário.</li>
	<li>Defina uma faca de corte ultrafino para a fase de faca.</li>
	<li>Ajuste a superfície da amostra e a navalha para que eles enfrentam paralelos uns aos outros usando a grande parte da superfície do espécime. Nota: A grande parte da amostra é usada para o ajuste porque a face de corte de seccionamento serial é tão pequena, que dificulta a ajustar a borda de superfície e faca de amostra usando esta parte só, especialmente no sentido vertical. Assim, usando a grande parte da amostra facilita o ajuste.</li>
</ol>5. espalhar a solução do neopreno do bloco de amostra (Figura 6)
<ol><li>Para colocar o chuck espécime em exatamente a mesma posição que a posição original, aplique a fita sobre o chuck e o chuck titular do micrótomo e cortar no limite do (Figura 6a).</li>
	<li>Retire o espécime chuck do micrótomo e colocá-la sob o microscópio estereoscópico (Figura 6b). Corte a grande parte da amostra com uma lâmina de barbear, deixando a parte de magro, do qual seriais seções serão obtidas.</li>
	<li>Com uma pipeta Pasteur, solte cerca de 1 µ l 0.5% do neopreno solução (Figura 6b) para a amostra a ser usada para o seccionamento serial, para fazer o adesivo de lados de seção. Cobrir o espécime com solução de neopreno. Absorva a solução de neopreno excesso imediatamente com um pedaço de papel de filtro colocado perto da amostra. Uma fita de seções é essencial para tirar fotos das seções de celular serial e cola neopreno é muito útil para furar as seções junto.</li>
	<li>Preparar 3 fenda grades (tamanhos de fendas: médio, 0,4 mm x 2,2 mm, ambos os lados 0,2 x 2,2 mm) (Figura 6C) para pegar seriais seções dobrando o punho das grades para 60 °, tratando as grades com solução de neoprene de 0,5% e fazendo as grades hidrofílico por de descarga do fulgor22.</li>
</ol>6. fazer seções seriais (Figura 7-9)
<ol><li>Lugar do bloco de amostra chuck volta em micrótomo na mesma posição como 5.1 (Figura 6a), alinhando as peças gravadas. Isso mantém a face do bloco e o fio da navalha perfeitamente paralelos uns aos outros. Depois trago a faca perto da amostra.</li>
	<li>Encha o barco de faca com água.</li>
	<li>Cubra o micrótomo com uma tampa de plástico para impedir o fluxo de ar (Figura 7). Nota: O fluxo de ar durante o seccionamento ultrafinos e recuperação das seções, muitas vezes causar problemas. A tampa de plástico tem três buracos: um buraco é para as lentes do binóculos, e outros dois furos são para os braços permitir a operação enquanto a tampa estiver ligada. O braço de madeira é usado para a colocação de braços enquanto fazia um trabalho delicado, como recuperar seriais seções com grades. O braço de madeira é colocado em tabelas diferentes da tabela micrótomo (Figura 7, setas), para não transmitir a vibração das mãos do operador para o micrótomo.</li>
	<li>Comece a cortar a amostra em espessura de corte de 200 nm (Figura 8). Configuração em espessura de 200 nm poupará tempo em trazer a faca para a superfície da amostra.</li>
	<li>Após a primeira seção é cortada, definir a espessura de corte de 70 nm (Figura 8).</li>
	<li>Quando o número de seções seriais atinge 20 (precisamente falando, depois os alcances de fita cerca de 1,8 mm; o número de seções varia de acordo com a largura das seções), definir a espessura de corte de 10 nm (Figura 8), continuando a cortar. Nota: Desde o micrótomo não pode cortar 10 nm de espessura seções, nenhuma nova seção aparece, e as seções previamente cortadas se separaram da borda de faca. É importante obter grupos de seções separadas (Figura 9) para pegar seriais seções para evitar a dificuldade em separar seções manualmente usando um par de fios de cabelo. Desde o campo de visão no microscópio de elétron da transmissão é de 2,0 mm, seções devem ser no máximo 1,8 mm de comprimento.</li>
	<li>Definir a espessura de corte de 60 nm (Figura 8). Isto produzirá 70 seções nm (Figura 8), porque a máquina irá adicionar a espessura de nm 10 anterior.</li>
	<li>Definir a espessura de corte para 70 nm (Figura 8) e continue o corte até 1.8 mm-longo seções são obtidas.</li>
	<li>Repita 6,6-6,8 até cinco seções longas de 1,8 mm são obtidas (Figura 9). Geralmente fazemos cinco grupos de seção, desde há cinco suportes de amostra no microscópio eletrônico de transmissão disponíveis em nosso laboratório, mas cinco não é o limite.</li>
</ol>7. pegar seriais seções (Figura 10-12)
<ol><li>Coloque a 'seção-exploração loop'23 (diâmetro interno do loop: 5,0 mm) (Figura 10a) sobre o terceiro grupo de seção (Figura 10b). Nota: É necessário recuperar as seções na ordem de sua corte para tirar fotos na ordem correta. No entanto, desde há cinco grupos de seção do barco de faca, isso muitas vezes Obtém confundindo quais os grupos que são. Colocando o loop no terceiro grupo, torna-se claro que os dois grupos perto do operador são o primeiro e o segundo e os dois distantes do operador são os grupos IV e v (Figura 10b). Isto impedirá que mistura-se a ordem.</li>
	<li>Coloque a ''água de superfície-sensibilização loop23 (WSRL, diâmetro interno do loop: 4,0 mm) (Figura 11a) na fase de faca (Figura 11b). O WSRL vai ficar firmemente no palco faca porque é equipado com um imã na parte inferior.<ol>
<li>Coloque o loop do WSRL acima as seções seriais movendo seu eixo e o punho. Baixe o loop do WSRL na superfície da água para que o laço circunda as seções.</li>
		<li>Empurre o loop através do parafuso para baixo para que a superfície da água irá disparar pela tensão de superfície (figuras 11-c-d). Mover a seção para o centro do laço, posicioná-lo no ápice da água e ajustar a direção da seção usando um fio de cabelo21.</li>
		<li>Buscar grupos de seção de tocá-lo com uma fenda-grade nua, que é realizada por uma pinça e mantida paralelo à superfície da água (Figura 11 d). É importante para as seções tocar na grelha em primeiro lugar, não a água, colocar seções precisamente no centro da grade (Figura 11 d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque as grelhas com seções juntamente com uma pequena gota de água sobre o Formvar suporte filme16 (Figura 12) e remover o excesso de água usando papel de filtro. Nota: Enrugamento do filme suporte é muitas vezes um problema quando seções são captadas usando uma grade com suporte de filme, porque a membrana (seções) toca a membrana (filme de apoio) diretamente. O problema de ficar com rugas no filme de apoio é significativamente reduzido, colocando uma grade de seção-rolamento juntamente com uma pequena gota de água sobre o suporte de Formvar filme16.</li>
</ol>8. coloração de seções16,24 (Figura 13)
<ol><li>Após as seções são completamente seco, rasgar o filme de Formvar ao redor das redes e retire as grades as seções do rolamento.</li>
	<li>Definir as grades na ranhura do tubo coloração16 na ordem correta (Figura 13) e mancha seções com uranilo acetato e chumbo citrato24. Nota: Há um sulco de 0,6 mm de profundidade ao longo do eixo do tubo de corte com uma lâmina de barbear. O tubo é útil para impedir a quebra acidental de suporte filmes quando usando uma pinça, uma vez que a manipulação direta de grades não é necessária durante o processo de coloração e lavagem16.</li>
</ol>9. observação das seções seriais (Figura 14)
<ol><li>Defina as 5 grades no porta-amostra multi na ordem correta (Figura 14a), orientando o eixo longo da grade fenda perpendicular ao eixo de suporte do espécime. As alças (setas) das grades não tem que ser cortado, porque os 'grade-fixadores' não tocará as alças.</li>
	<li>Fixar as grelhas com 'grade-fixadores' (Figura 14b) e introduza o suporte de amostra o microscópio eletrônico de transmissão. Nota: Muitas vezes é útil tomar baixa ampliação de imagens de todas as seções de célula (Figura 15) para achar interessante microorganismos ou células em bom estado com nenhuma contaminação e com boa fixação, antes de tirar fotos da célula alvo.</li>
	<li>Tire fotos das células alvo em todas as seções de célula em alta ampliação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+ultrastructure+of+yeast+cells+by+electron+microscopy.">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy.">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Exophiala+yeast+cells+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li><li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density.">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li><li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis,+which+survives+with+only+700+ribosomes+at+density+per+0.1+fl+cytoplasm.">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea.">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryote+or+eukaryote?+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea.">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning+of+the+Myojin+parakaryote+discovered+in+the+deep+sea.">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-sea+microorganisms+and+the+origin+of+the+eukaryotic+cell.">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método apresentado aqui não requer nenhum equipamento caro. Requer apenas um rack de alumínio (Figura 3), grades de três-fenda (Figura 6C), seção-exploração loops (Figura 10a), loop de água de superfície-sensibilização (Figura 11a) e um tubo de coloração (Figura 13). Há muitas características do presente método. A grande parte da amostra é usada para aju...

Técnica de corte apropriada serial ultrafino é indispensável para o estudo de células e componentes celulares tridimensionalmente em nível microscópico elétrons. Temos estudado a dinâmica do corpo de polo do eixo no ciclo celular de células de levedura e revelou alterações morfológicas da sua ultra-estrutura durante o ciclo celular e o tempo de duplicação1,2,3, 4,5. Em 2006, cunhou uma nova palavra 'structome' combinando 'estrutura' e '-ome' e definiu-o como o 'informações quantitativas e tridimensional estrutural de uma célula inteira em nível microscópico elétrons' 6,7.
Pela análise de structome, que requer técnica de seccionamento serial ultrafino, verificou-se que uma célula de levedura Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis tinha cerca de 200.000 ribossomos7,8, um Escherichia coli célula tinha 26.000 ribossomas9, uma célula de Mycobacterium tuberculosis tinha 1.700 ribossomas10 e bactérias de espiral Myojin tinham apenas 300 ribossomas11. Esta informação é útil na estimativa não somente a taxa de crescimento em cada organismo, mas também na identificação das espécies9.
Análises posteriores, structome levado à descoberta de um novo organismo; Parakaryon myojinensis foi encontrado no fundo do mar na costa do Japão, cuja estrutura de célula era um intermediário entre aqueles de procariotas e eucariotas12,13,14,15. Presentemente, técnica de corte ultrafino serial é considerada tão difícil que levaria muito tempo para dominar. Neste estudo, nós desenvolvemos um método confiável, no qual qualquer um pode executar seccionamento ultrafinos serial sem dificuldade.

<table><tbody><tr><td>Formvar making apparatus</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>652</td><td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td><td>-</td><td>76 x 26 x 1.3 mm</td></tr><tr><td>Aluminum rack with 4-mm holes</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>658</td><td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SMZ 645</td></tr><tr><td>LED illumination for stereomicroscope</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td></tr><tr><td>LED illumination for trimming stage</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Ultrasonic trimming blade</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>5240</td><td>EM-240, Refer to this paper</td></tr><tr><td>Diamond knife for trimming</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td><td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td><td>-</td><td>45&amp;deg;</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Ultracut S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems, Vienna</td><td>-</td><td>Mirror</td></tr><tr><td>0.5% Neoprene W solution</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Special 3-slit nickel grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2458</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Special 3-slit copper grid</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>2459</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Section-holding loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>526</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Water-surface-raising loop</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>527</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Staining tube</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>463</td><td>Refer to this paper</td></tr><tr><td>Multi-specimen holder</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>EM-11170</td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td><td>-</td><td>Transmission electron microscope</td></tr></tbody></table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

Observação de células e componentes da célula em três dimensões em alta ampliação em microscopia eletrônica de transmissão exige a preparação de seções ultra-finas seriais do espécime. Ainda preparar seções ultra-finas seriais é considerado muito difícil, é bastante fácil... se for usado o método adequado. Neste trabalho, mostramos um procedimento passo a passo para a obtenção de segurança seriais seções ultra-finas de microorganismos. Os pontos-chave deste método são: 1) para usar a grande parte da amostra e ajustar a borda de superfície e faca de amostra, de modo que eles são paralelos uns aos outros; 2) para cortar seções seriais em grupos e evitar a dificuldade em separar seções usando um par de fios de cabelo ao recuperar um grupo de seções seriais para as grades de fenda; 3) usar um 'loop' seção-exploração e evitar mistura-se a ordem dos grupos seção; 4) para usar um loop de' água de superfície-sensibilização' e certifique-se que as seções são posicionadas no ápice da água e que tocam a grade em primeiro lugar, a fim de colocá-los na posição desejada nas grades; 5) para usar o suporte de filme em um rack de alumínio e torná-lo mais fácil para recuperar as seções sobre as grades e evitar enrugar-se do filme suporte; e 6) para usar um tubo de coloração e evitar quebrar acidentalmente os filmes de apoio com uma pinça. Este novo método permite a obtenção de seções ultra-finas seriais sem dificuldade. O método torna possível analisar estruturas celulares dos microorganismos em alta resolução em 3D, que não pode ser alcançado usando o método de ultramicrotome de fita de coleta automática e bloco-rosto serial ou microscópio eletrônico de varredura de feixe de íon focalizado.

Neste protocolo, fenda três grades foram usados para pegar seriais seções. As grades são feitas de níquel ou cobre. As seções seriais são colocadas na ranhura do meio. As fendas em ambos os lados são necessárias para ver as seções quando pegá-los com a grade. Para manter as grades paralelas com as seções seriais quando pegá-los com uma pinça (Figura 11 d), o punho é dobrado (Figura 6C, direita). Uma pequena alç...

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Este estudo apresenta procedimentos confiáveis e fácil de obtenção de seções ultra-finas seriais de um microorganismo sem equipamentos caros em microscopia eletrônica de transmissão.

Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

a-method-for-obtaining-serial-ultrathin-sections-microorganisms

Research

JoVE Journal

Engineering

14.1K visualizações.  Chiba University. Este estudo apresenta procedimentos confiáveis e fácil de obtenção de seções ultra-finas seriais de um microorganismo sem equipamentos caros em microscopia eletrônica de transmissão.

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Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Bioquímica

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Bioengenharia

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Electron Cryotomography de células bacterianas

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biologia

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Neurociência

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto Drosophila revelada pela série-seção elétron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Congelamento rápido usando dispositivo de congelamento de sanduíches para boa preservação ultraestrutural de espécimes biológicos em microscopia eletrônica

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

Caracterização tridimensional de Sítios de Contato Interorganelle em Hepatócitos usando Microscopia eletrônica de seção serial

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...