Esses estudos visam fornecer sistemas de modelos robustos e reprodutíveis para realizar estudos específicos de orientação do epitélio intestinal. Organoides apical podem ser gerados em alto número e manter a promessa de triagem de alto rendimento. Monocamadas são mais fáceis de serem manipuladas e oferecem acesso a sinais apical e basais.
Certifique-se de que o tamanho dos organoides é de 150 a 250 micrômetros de diâmetro antes de iniciar o protocolo de inversão. Remova e descarte cuidadosamente o meio de cada poço contendo organoides sem interromper a cúpula ECM. Adicione um mililitro de solução de dissociação gelada a cada poço e incubar a placa em temperatura ambiente por um minuto.
Desaloja cuidadosamente as cúpulas, pipetando lentamente com uma ponta revestida, tomando cuidado para não interromper e fragmentar os organoides. Transfira a suspensão organoide para uma placa tratada com solução anti-adesão e coloque a placa em um agitador a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, remova a placa e encobre suavemente a solução para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de um mililitro revestida com solução anti-adesão.
Coloque a placa no shaker a quatro graus Celsius por mais 30 minutos. Remova a placa e deixe os organoides se acalmarem por gravidade por um a dois minutos em temperatura ambiente. Após os organoides se estabelecerem, remova o máximo possível da solução de dissociação e lave-os adicionando 1,5 mililitros de DMEM F-12.
Permita que os organoides sedimentem e remova o supernante. Em seguida, repita a lavagem. Remova o máximo possível do DMEM F-12 e adicione 0,5 mililitros de meio de expansão organoide intestinal.
Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, realize uma mudança média parcial inclinando a placa em um ângulo de 25 a 30 graus e removendo o meio ao longo da parede do poço tomando cuidado para não remover organoides suspensos. Adicione 0,4 mililitros de expansão organoide intestinal média e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias.
Se os agregados tiverem formado use uma ponta de pipeta de um mililitro revestida com solução anti-aderente para esbranquiçando os agregados, pipetando para cima e para baixo 20 vezes enquanto pressiona a extremidade da ponta para a parte inferior da placa. Adicione um mililitro de pré-aquecido 0,05% Trypsin-EDTA aos organoides resusgasuspend. E misture bem para garantir uma suspensão uniforme.
Adicione a um mililitro adicional de Trypsin-EDTA para um grande número de células, ou se uma quantidade significativa de ECM permanece. Incubar a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos, em seguida, misture completamente com uma pipeta de um mililitro para interromper os organoides de modo que eles são completamente dissociados em células únicas ou pequenos fragmentos. Para dissociar completamente fragmentos ou organoides inteiros continuem a incubação com Trypsin-EDTA a 37 graus Celsius por mais três a cinco minutos.
Uma vez que os organoides são suficientemente dissociados adicione um volume igual de DMEM F-12 e pipeta para cima e para baixo para misturar completamente. Inative o Trypsin-EDTA adicionando 10% de FBS às células. Fragmentos de centrífuga a 200 vezes G por cinco minutos a dois a oito graus Celsius.
Se os organoides dissociados falharam em misturar as células completamente, pipetando para cima e para baixo e centrifuá-las novamente. Remova cuidadosamente o máximo de supernaspeso possível. Deixando apenas a pelota de celular.
Resuspense as células em 100 microliters de meio de diferenciação organoide intestinal para cada poço a ser semeado. Ajustando o volume adequadamente para tamanhos de poços maiores ou menores. Remova as placas revestidas da incubadora e remova a solução de matriz de membrana do porão em excesso de cada poço.
Adicione 100 microliters da suspensão celular ao poço superior de cada inserção de cultura celular e 500 microliters de meio de diferenciação organoide intestinal ao poço inferior. Em seguida, incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Substitua o meio tanto nos poços superiores quanto inferiores a cada dois ou três dias.
Para estabelecer uma cultura ALI remova o meio dos poços superiores e inferiores, e adicione o meio de diferenciação organoide intestinal fresco ao poço inferior deixando o poço superior vazio. Os organoides intestinais cultivados com meio de expansão organoide intestinal apresentaram uma morfologia cística. Quando o ECM é removido alguns organoides tendem a agregar durante os três primeiros dias e precisam ser eliminados para aumentar o número organoide.
Os organoides intestinais cultivados no ECM continuaram a expandir e apresentar formação espontânea de estruturas secundárias de brotamento. Organoides mantidos por cinco dias na ausência de matriz extracelular apresentaram formas alongadas, císticas e irregulares. A expressão de marcadores atípicos, como villin e ZO-1 foi detectada no lado externo do epitélio que foi exposto ao meio.
Organoides incorporados do ECM manchados por núcleos, villin e ZO-1 demonstrando uma polaridade basal apical onde o lado apical estava voltado para o lúmen do organoide. Uma vez que a monocamada foi estabelecida as células formaram junções apertadas e uma camada confluente. A camada confluente também orienta sua villin contendo borda de escova em direção ao lado apical do epitélio, formando complexos multifissivos ZO-1 entre as células.
Transição para uma cultura ALI induziu ainda mais diferenciação com células de cálice mais proeminentes que foi visualizada pela coloração para a proteína de mucina secreta MUC2 Para induzir a inversão polaridade é crucial remover todo o ECM sem interromper ou fragmentar as organoides. Alterações na mídia também devem ser feitas com cuidado para evitar a remoção de qualquer um dos organoides suspensos. Garantir que haja células únicas suficientes para o estabelecimento da cultura monocamada é um dos principais determinantes de sua qualidade.
Funções específicas apical, como absorção de nutrientes ou interações de patógenos hospedeiros, agora ele estudou em sistemas relevantes que atendem às necessidades dos pesquisadores.
