Monocamadas derivadas de organoides recapitulam a função da barreira epitelial intestinal do paciente e permitem testar o efeito de terapias destinadas a melhorar a disfunção em cada paciente para identificar estratégias de tratamento personalizadas. Monocamadas organoides fornecem acesso ao lado apical do epitélio, que é o lado onde o dano ocorre, e é normal e acessível em organoides crescendo como estruturas 3D. Cada organoide é diferente, daí a luta.
Para formar monocamadas apertadas, use organoides em fase de proliferação e digera rapidamente para formar aglomerados de duas a quatro células. Titular a semeadura celular para cada modelo. Demonstrar que o procedimento será feito por Wies Van Dooremalen, um pesquisador sênior associado da HUB.
Comece por revestimento de pastilhas de membrana com matriz extracelular ou ECM. Trabalhando em um armário de biossegurança, coloque as inserções de membrana na placa de suporte. Diluir o ECM 40X no GELO frio DPBS com cálcio e magnésio, em seguida, pipeta 150 microliters do ECM diluído no compartimento apical de cada inserção.
Incubar a placa a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Para preparar as células para semeadura, pré-aquecimento uma alíquota de reagente de dissociação celular em um banho de água de 37 graus Celsius. Use dois mililitros do reagente para cada poço de uma placa de seis poços.
Transfira a placa de cultura contendo os organoides da incubadora para o armário de biossegurança. Processe os organoides conforme descrito no manuscrito do texto, mas não poça vários tubos em um tubo. Depois de colher os organoides, adicione meio basal ou BM a 12 mililitros e centrífuga a 85 vezes G, depois aspire o supernante.
Encha o tubo contendo os organoides com até 12 mililitros de DPBS, em seguida, pipeta para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta de 10 mililitros. Centrifugar a 85 vezes G por cinco minutos a oito graus Celsius e aspirar o supernaente sem perturbar a pelota organoide. Adicione o reagente de dissociação celular pré-aquecido aos organoides e resuspenque-os, em seguida, incubar os tubos diagonal ou horizontalmente por cinco minutos no banho de água a 37 graus Celsius.
Após a incubação, pipeta para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta de plástico estéril de cinco mililitros ou uma pipeta P1000. Verifique a suspensão organoide sob o microscópio para ver se uma mistura de células únicas e algumas células compostas por duas a quatro células se formou. Pare a dissociação celular somando 12 mililitros de BM com inibidor de ROCHA à suspensão celular.
Centrifugar as células, em seguida, aspirar o supernatante sem perturbar a pelota celular. Ao manusear a mesma cultura organoide em vários tubos, acumule as pelotas celulares antes de resususá-las em 12 mililitros de BM. Filtre a suspensão celular através de um coador de 40 micrômetros pré-molhado com BM e colmeia o fluxo através de um tubo cônico de 50 mililitros, depois lave o coador com 10 mililitros de BM e colmeça o fluxo através do mesmo tubo. Transfira a suspensão celular tensa em dois novos tubos cônicos de 15 mililitros e repita a centrifugação.
Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular e resuspense as células em quatro mililitros de IEM suplementados com 10 inibidores de ROCK micromolar por placa de cultura completa usado como material inicial. Misture uma pequena quantidade de suspensão celular em uma proporção de um para um com Trypan Blue para contagem, em seguida, conte as células e calcule o número total de células vivas, contando cada célula individual em pequenos aglomerados. Prepare uma suspensão celular contendo 3X 10 a sexta células vivas por mililitro de IEM suplementado com 10 inibidores de ROCK micromolar.
Para semear as células, aspire cuidadosamente o DPBS das pastilhas revestidas de ECM, mantendo a placa horizontal. Pipetas 800 microliters de IEM complementados com inibidor de ROCHA em cada compartimento basolateral e 150 microliters da suspensão celular preparados na membrana revestida de ECM no compartimento apical dropwise. Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Uma vez que as células tenham sedimentado na membrana, meça resistência elétrica transepitelial ou TEER todos os dias e imagem a membrana insere usando um microscópio. Para refrescar as monocamadas, remova o meio dos compartimentos basolaterais da placa contendo as pastilhas de membrana e, em seguida, aspire cuidadosamente o meio dos compartimentos apical. Adicione 150 microliters de IEM frescos dropwise a cada compartimento apical e adicione 800 microliters de IEM fresco a cada compartimento basolateral.
Se usar um medidor de TEER manual, limpe o eletrodo com 70% de etanol e deixe-o secar dentro do armário de biossegurança, em seguida, coloque o eletrodo em um tubo contendo BM. Conecte o eletrodo ao medidor TEER manual e gire o interruptor de função para medir em ohms e o interruptor de alimentação ligado. Coloque o eletrodo curto no compartimento apical da pastilha e o eletrodo longo no compartimento basolateral sem tocar na monocamada. Meça a resistência no poço em branco, em seguida, nas amostras restantes.
Lave o eletrodo com BM entre amostras com condições diferentes. Quando terminar, limpe o eletrodo com água demi e com 70% de etanol, depois deixe-o secar. Este protocolo foi usado para colher organoides intestinais e preparar monocamadas de células epiteliais.
Uma monocamadas que foi cultivada por oito dias no IEM é mostrada aqui. Uma estrutura pode ser observada ao expor monocamadas para enterócito meio de diferenciação ou EDM, enquanto monocamadas expostas ao meio de combinação ou MDL mostram uma estrutura mais suave. A formação de monocamadas foi acompanhada quantitativamente pela medição do TEER.
Uma monocamada completamente confluente tinha um valor TEER de aproximadamente 100 centímetros quadrados que aumentava quando exposto a qualquer meio de diferenciação. Monocamadas em todas as condições médias apresentaram menor permeabilidade aparente ao amarelo Lúcifer. A secreção de lysozyme por monocamadas ileais cultivadas no IEM foi maior do que a de monocamadas cultivadas no IEM até confluente e por mais quatro dias no EDM ou MDL.
Monocamadas cultivadas em IEM, IEM e EDM subsequentes, ou IEM e MDL subsequentes mostram diferenças na morfologia que foi observada com as manchas de H&E, Ki67, MUC2 e Alcian Blue. Após a diferenciação, as células proliferativas diminuíram, enquanto a expressão genética de células de cálice e enterócito aumentou em comparação com a observada nas condições do IEM, como mostrado pela lgr5, MUC2 e expressão genética alcalina fosfatase. Ao preparar monocamadas, é importante prevenir anoikis nos organoides depois de digeri-las.
Além disso, o ECM nas células deve ser distribuído uniformemente nas membranas Transwell. Monocamadas derivadas de organoides permitem a avaliação dos transportes de moléculas usando diferentes substratos fluorescentes de forma específica do paciente.
