Koo BK e Mustata RC são suportados pelo Sir Henry Dale Fellowship do Wellcome Trust e Andersson-Rolf A é apoiada pelo Conselho de Pesquisa Médica (MRC). Fink J é apoiado pelo Programa de Doutoramento-4-year Wellcome Trust.

Todos os ratos utilizados no seguinte protocolo foram mantidos em condições livres de patógenos específicos, e todos os procedimentos foram realizados de acordo com os regulamentos do Reino Unido Home Office. 1 Preparação <ol><li> Prepare a mídia de 1 hora antes do uso (ver Quadro 1 e Lista de Materiais para mais detalhes) e pré-aquecido em um banho de água C ​​37 °, pelo menos, 10 minutos antes de usar. </li></ol> 2 A cultura do Intestino Delgado (SI) Organóides NOTA: A menos que indicado de outra forma, todas as incubações são realizadas a 37 ° C, 5% de CO 2, num incubador humidificado. Equipamento e reagentes que entram em contacto com as células vivas têm de ser estéreis. Pré-aquecimento da placa de cultura de tecidos é importante, pois evita que a matriz de cave (Matrigel ou BME) gotas de se espalhar para fora quando a semeadura. Além disso, a matriz deve ser porão mantida em gelo durante todo o tempo. Armazenar a -20 ° C e descongelamentoem gelo antes do uso. <ol><li> Isolando criptas <ol><li> Para o isolamento do intestino delgado sacrificar o mouse de acordo com as normas e regulamentos nacionais, em seguida, colocar o animal em suas costas e lavar o abdômen com etanol 70%. Realize uma incisão mediana longitudinal desde a virilha até o esterno. Em primeiro lugar, cortar a pele e, em seguida, o tecido subcutâneo. Remover o intestino delgado a partir do ceco para o estômago. Isoladas a partir de criptas do duodeno, jejuno e íleo pode ser utilizado para a cultura organï¿½de. </li><li> Lave o intestino delgado isolado com pré-resfriado Phosphate-Buffered Saline sem cálcio ou magnésio (PBS0). </li><li> Corte o tecido em 3-5 cm de comprimento peças e use uma tesoura para cortá-la aberta longitudinalmente. Espalhar o tecido, utilizando fórceps. </li><li> Raspe vilosidades usando uma lamela. Cuidado, muita força fará com que o tecido de rasgar e irá reduzir o rendimento de criptas em passos seguintes. </li><li> Transferir o tecido para um tubo de 50 ml, contendo pré-arrefecida usin PBS0fórceps g. Lave os fragmentos de tecido através de agitação vigorosa e mudar o PBS0. Repita 2-3x ou até o PBS0 gira menos nublado. </li><li> Incubar o tecido em um tubo de 50 ml contendo 30 ml de PBS0 com 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) durante 30 min a 4 ° C em um tubo de rolo. </li><li> Agitar vigorosamente o tubo e transferir o tecido para outro tubo de 50 ml contendo 30 ml de PBS0 com 5 mM de EDTA. A solução de EDTA a 1 mM (previamente contendo o tecido) irá conter uma mistura de criptas e vilosidades. Esta fração não é adequado para a semeadura de Organóides como muitas vezes contém uma elevada percentagem de vilosidades. </li><li> Incubar o tecido ainda durante 1 hora a 4 ° C em um tubo de rolo. </li><li> Agitar vigorosamente o tubo e recolher a solução em um tubo de 50 ml limpo. Confirmar a presença de criptas e estimar o número, por exemplo, através da contagem das criptas em 50 ul por microscopia de luz. Calcula-se o volume necessário para se obter 50-100 criptas e transferi-lo para um 1,5 ml de tube. </li><li> Gire a 300 xg por 5 min. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 50 mL de matriz de porão, e sementes de uma pré-aquecido placa de 24 poços. Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos de 5-15 minutos de modo que a matriz de porão polimeriza. </li><li> Sobreposição com 500 ul ENR médio (ver Tabela 1). Aproximadamente 24 horas após a semeadura das Organóides irá mostrar uma pequena forma cística redonda e após mais 2-3 dias brotamento estruturas tornam-se visíveis. Mude a mídia ENR frescas a cada 3 dias. </li><li> Passage organóide culturas a cada 7 dias. </li></ol></li><li> Passaging e Organóides Manutenção <ol><li> Manter os Organóides atualizando os meios de comunicação a cada 3 dias e passagem 1: 3 ou 1: 5 como o lúmen se enche de células mortas, aproximadamente a cada sete dias. </li><li> Quebre a matriz cúpula porão com meio com 1 ml ponta PIPETMAN e transferi-lo do poço para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Mecanicamente dissociar os Organóides através de uma pipetapproximately 50x usando uma multa (por exemplo, 200 mL) de ponta. </li><li> Gire a 300 xg por 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 150-250 mL de matriz porão. Semente de uma pré-aquecido placa de 24 poços (50 ul de matriz basal / poço). Antes de semear pipeta da matriz basal para cima e para baixo uma vez, para o revestimento de parede da ponta. Pipeta-se lentamente para evitar as bolhas e as sementes no meio do poço para evitar a matriz basal se espalhe para fora. É desejável para obter uma matriz de cúpula do porão, no centro do poço. </li><li> Incubar numa incubadora de cultura de tecidos de 5-15 minutos de modo que a matriz de porão polimeriza. Overlay com 500 mL de mídia ENR por poço. </li></ol></li></ol> 3 Pré-Tratamento de infecção SI Organóides NOTA: A Figura 1 ilustra o procedimento de transdução. <ol><li> Taxas ENR para ENRWntNic (ver Tabela 1) médio e crescer os Organóides em tseu meio para um mínimo de 3 dias ou até que eles adotaram uma morfologia cística. Wnt3a aumenta o número de células estaminais e de Paneth enquanto nicotinamida (NIC) melhora a eficiência da cultura. </li></ol> 4 Vírus Produção <ol><li> É necessário 150 mm prato de células Platinum-E por infecção. Semente de aproximadamente 5 x 10 6 células, com 15-18 ml de meio (DMEM + FBS 10%), na presença de puromicina (1 jag / mL) e blasticidina (10 ug / ml). Transfecção de células após 2-3 dias, depois de terem atingido 70-80% de confluência. Mudar o meio de DMEM + 10% FBS sem ï¿½puromicina e blasticidina antes da transfecção. </li><li> Adicionar 30 mg de construção de ADN retroviral e 240 mL de polietilenimina (PEI) para separar os tubos, contendo 1 ml de Opti-MEM. Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Reunir as duas soluções e incuba-se à temperatura ambiente durante 20-30 min. Adicione a mistura completa para o meio de células Platinum-E e agitar cuidadosamente o plate para assegurar uma distribuição equitativa dos complexos DNA-PEI. </li><li> Incubar as células E-platina com a mistura de transfecção durante a noite e refrescar o meio no dia seguinte. Manter as células em meio novo durante 2 dias. </li><li> Recolhe apenas a forma de um tubo Falcon de 50 ml, que passam através de um filtro de 0,45 um e de centrifugação a 8000 xg, a 4 ° C durante 12-16 horas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 ul de meio de transdução (ver Tabela 1). </li></ol> 5. organóide Fragmento Preparação <ol><li> Para uma infecção de um poço de uma placa de 24 cavidades é necessário. Quebre a matriz cúpula porão com meio com 1 ml ponta pipeta e transferir para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Utilizar um volume de ponta fina (por exemplo, de 200 pontas ul) para romper mecanicamente os Organóides através de pipetagem (30-50x). A solução torna-se turva e não Organóides integrais devem ser visíveis. </li><li> Centrifuga-se a temperatura ambiente, 900 x g durante 5 min<html> . </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de protease recombinante de grau de cultura de células (por exemplo, TrypLE). Incubar a 37 ° C durante 5 min. Após a incubação, verificar o tamanho dos fragmentos por meio de microscopia de luz organï¿½de, contando o número de células por fragmento. Fragmentos contendo 5-10 células são ideais. Se a maioria dos fragmentos de conter um maior número de células do tempo de incubação pode ser aumentado por 2 minutos de cada vez. </li><li> Terminar o processo de dissociação, adicionando 500 mL de meio de ENR. </li><li> Centrifuga-se a temperatura ambiente, 900 x g durante 5 min. Remover o sobrenadante e o sedimento de manter em gelo ou a 4 ° C. </li></ol> 6. Transdução retroviral <ol><li> Combinar fragmentos organï¿½de com 250 ul da solução retroviral (de secção 4.5) em um poço de uma placa de 48 poços. Misture delicadamente por pipetagem lento usando uma pipeta de ponta ml. </li><li> Selar a placa com Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation e Galvanização <ol><li> Centrifugar a placa a 32 ° C, 600 x g, durante 1 hora. Retire cuidadosamente o Parafilm e incubar a placa em uma cultura de tecidos incubadora durante 6 horas. </li></ol> 8 Sementeira de infectados organóide Fragments <ol><li> Transferir os fragmentos organï¿½de infectadas e media a transdução do poço para um tubo de 1,5 ml, e de centrifugação a 900 xg durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e colocar o tubo contendo o sedimento em gelo durante 5 minutos para arrefecer. Adicione 100 ml de matriz porão e colocar o agregado pipetando lentamente para cima e para baixo. </li><li> Gotas de semente de matriz &#39;porão -cell misturar&#39; 50 ul de uma nova placa de 24 poços. Incubar a placa a 37 ° C, durante 5-15 min, até que os solidifica matriz basal. </li><li> Adic transdução sem polibreno aos poços e incuba-se a placa numa incubadora de cultura de tecidos. Mudança de mídia a cada 2-3 dias. </li></ol> 9 Seleção <ol><li> Comece seLection após 2-3 dias, adicionando ï¿½puromicina (1 mg / ml) para a mídia. </li><li> Quando os fragmentos estão começando a formar Organóides substituir os meios de comunicação com os meios Transdução ENR suplementados com puromicina (1 jag / ml). </li></ol> 10 pós-infecção Tratamento de SI Organóides <ol><li> Cultura transduzidas Organóides de acordo com o &quot;Passaging e manter Organóides&quot; protocolo (seção 2.2.1). Depois de 1-2 semanas, os Organóides SI vai recuperar as suas estruturas de brotamento. </li><li> Após o aparecimento de estruturas de brotamento induzir a expressão de miARN ou ADNc por adição de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) em uma concentração de trabalho de 1 uM. Note que este passo só é válida se estiver usando vetores retrovirais de Addgene (pMSCV-loxP-dsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-dsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32.703), e pMSCV -FLIP-puro-dsRed-GFP-miRNA (32704)) e Organóides expressam Cre-ERT2. </li></ol> 11. confirmação da infecção e Expressão / Supressão do gene de interesse <ol><li> Se utilizar os vectores retrovirais da Addgene (32702, 32703 e 32704) eficiência de transdução pode ser confirmado pela observação da expressão dsRed. Além disso, a expressão ou a repressão do gene de interesse pode ser confirmada através de Western Blot, utilizando o GFP ou 3xHA epitopo (para a sobre-expressão do gene) e de qPCR (para knockdown do gene), conforme exemplificado na Koo et al 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Para atingir alta eficiência de transdução de certos aspectos são fundamentais. Um deles é o pré-tratamento de Organóides com a mídia ENRWntNic até que adotar uma forma cística rodada. Isto aumenta o número de células estaminais e, assim, a possibilidade de obter uma integração estável do transgene, bem como aumentar a taxa de sobrevivência dos Organóides SI durante todo o procedimento de transdução. Outro parâmetro é o tempo de incubação seguinte spinoculation. Resultados de incubação muito curto ou muito longo em baixa eficiência de transdução e baixa sobrevida dos Organóides, respectivamente. O passo spinoculation não é essencial, embora ele aumenta significativamente a percentagem de Organóides transduzidas. Finalmente, vírus de título elevado é a chave para a transdução de sucesso. Isto é dependente do tipo de linha de células de empacotamento e vírus. A combinação de uma linha celular de platina-E e vírus de células estaminais de murino (MSCV), verificou-se produzir um título suficientemente elevado para a transdução de Organóides. ve_content &quot;&gt; Abaixo são dicas para solução de problemas que podem ajudar a alcançar transdução de sucesso. Em primeiro lugar, se a transfecção da linha de células de empacotamento é pobre, certifique-se de que a confluência das células situa-se entre 70-80%, e que o tempo de incubação do agrupada mistura PEI-ADN é entre 20-30 min. A sobrevivência dos Organóides durante transdução altamente depende do tamanho do fragmento. demasiado longo tripsinização faz com que a maioria dos fragmentos de consistir em menos de 3 células e, assim, diminui a capacidade de sobrevivência organï¿½de. Outro factor é a actividade do meio condicionado de Wnt, se a actividade é muito baixa, impulsionando-o por meio da adição de CHIR99021 numa concentração de 5 fiM de trabalho pode aumentar a sobrevivência. CHIR99021 inibe a GSK3, o que resulta num aumento da sinalização de Wnt. Além disso, Y-27362, o qual impede anoikis é adicionado ao meio para melhorar a capacidade de sobrevivência de transdução organï¿½de, uma vez que são rompidas as Organóides de fragmentos (contendo 1-10 células) antes da transdução. Como60; mencionado acima, o tempo de incubação após spinoculation não deve ser superior a 6 horas. Por fim, se a transdução pobre é observado os factores acima mencionados influenciam o título viral e o limite de tamanho da inserção para o vector retroviral devem ser considerados. A eficiência do knockdown é altamente dependente da miARN. Uma vez que a eficiência varia de acordo com a combinação do gene alvo e miARN vale a pena realizar uma tela eficiência para identificar aqueles que funcionam melhor. A técnica é restrito para os fenómenos epiteliais do sistema organï¿½de. No futuro, pode ser possível estudar as doenças infecciosas ou imuno-mediada através da co-cultura de agentes patogénicos ou a reconstituição com componentes derivadas do sistema imune, respectivamente. Além disso, os retrovírus só pode efectuar inserções de um tamanho relativamente pequeno. Por conseguinte, as regiões reguladoras de ocorrência natural têm de ser excluídos e, portanto, a expressão do transgene não pode imitar o deo gene endógeno. Como mencionado acima, a eficiência de knockdown depende do gene alvo e miARN. Se não miARN com eficiência knockdown adequado pode ser encontrado, pode limitar o uso da técnica em que o gene alvo em particular. Teoricamente, Organóides são compatíveis com todas as técnicas de manipulação padronizados utilizados para linhas celulares. Transdução retroviral foi o primeiro método a ser relatado 4, e, recentemente, BAC (cromossomo artificial bacteriano) -transgenesis tornou-se disponível 5. Com um tempo de geração total de 2-3 semanas, após a transfecção do plasmídeo virai na linha celular de empacotamento, que é significativamente mais rápida do que a geração de um transgénicos (tg) do rato. Através da manutenção da arquitectura cripta-vilosidade in vivo, enquanto que contém as células estaminais, bem como todas as linhagens de células diferenciadas do epitélio intestinal, o sistema de cultura organï¿½de preenche a lacuna entre tg e cultura de células de animais utilizadas anteriormente. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; O protocolo aqui descrito fornece um método para realizar a análise fenotípica de endodermal epitélio in vitro através gain- e sem perdas de estudos da função. Isso torna possível para abordar questões fisiologicamente relevantes na biologia das células-tronco adultas, com uma necessidade mínima de tg. Por exemplo, a geração de ratinhos knockout condicionais pode ser evitado pelo uso de derivados de mutantes Organóides-nascidos com letalidade perinatal 6. Além disso, a técnica pode ser aplicada a Organóides derivadas de ratinhos knockout previamente estabelecidos para estudar o papel de paralogues efectuando 7,8 knockdown adicional. Após o estabelecimento de pequenas Organóides intestinais, adaptação do protocolo de cultura original permitiu cultura de pâncreas, fígado, cólon e estômago epitélios 9-11. Além disso, Organóides intestinal humana e Organóides tumorais foram extraídos de biópsias humanas normais, aden primáriooma e câncer colorretal biópsias 10. O protocolo de infecção viral pode ser facilmente estendido para estes tipos de Organóides e fornece uma forma sem precedentes de realização de estudos funcionais em tecidos de origem humana. Tomados em conjunto, transdução retroviral de pequenas Organóides intestinal é um recurso valioso para a investigação de manutenção de células estaminais, a diferenciação ea decisão destino celular, bem como a sinalização celular e de células célula-interações.

Genética funcional de alto rendimento é necessário para aumentar a nossa compreensão biológica do corpo, para melhorar a ciência básica atual e medicina. Mouse genética tem sido o padrão ouro para investigar a função do gene in vivo, embora seja tanto demorado e caro. As linhas celulares, sendo a outra opção comum, tem uma capacidade de produção mais elevada, enquanto ser menos dispendioso. No entanto, elas são impedidos pela sua incapacidade para reproduzir o microambiente adequado e deste modo, as respostas fisiológicas in vivo visto. Assim, existe uma necessidade para um sistema sem ambiguidade modelo fácil de manusear, que permite que o custo / eficiente em termos de tempo de análise de alto rendimento, enquanto imitando as respostas fisiológicas observadas em experimentos in vivo transgênicos (Tg) do mouse. Para o epitélio endodermal um tal sistema modelo apareceu em 2009 1. Entre os conhecimentos adquiridos a partir da descoberta de células-tronco intestinais Lgr5-positivos foiInformações sobre o nicho correspondente aos factores de crescimento e da matriz extra-celular necessárias para a manutenção de células estaminais. Utilizando esta informação, tornou-se possível estabelecer &#39;mini-intestinos&#39;, também conhecidos como Organóides 2. Recentemente, uma nomenclatura de consenso para culturas in vitro, onde Organóides são referidos como &#39;enteroids&#39;, foi sugerido 3. Como linhas celulares, os Organóides estão em constante expansão e fácil de tratar com ligantes e inibidores. No entanto, em vez de ser bidimensional são estruturas tridimensionais auto-organização que retêm a organização cripta-vilosidade, assim como as células estaminais e as linhagens de células diferenciadas do intestino delgado (SI). Organóides constituído por uma única camada de células epiteliais que circundam a área luminal. Salientes estruturas brotamento correspondem a criptas do intestino delgado, contendo compartimento de células estaminais. A partir da ponta da estrutura de brotamento células progenitoras diferenciam em que miralar para o revestimento epitelial, onde as células terminalmente diferenciadas são derramadas para o lúmen. Em comparação com as linhas celulares, este sistema ex vivo recapitula mais de perto a fisiologia normal e, portanto, é um sistema modelo interessante para o epitélio do intestino delgado. Neste protocolo vídeo de transdução retroviral, apresentamos um método que permite estudos ex vivo a função do gene, neste novo sistema de cultura organóide. Começamos descrevendo organï¿½de cultura de um modo passo-a-passo, e continuam a demonstrar a geração de retrovírus, seguido pelo procedimento de transdução. Finalmente, há uma seção para conselhos adicionais para solução de problemas. Uma vantagem desta técnica é que ele pode ser combinado com a imagem ao vivo ou rastreio de drogas, para o estudo da homeostase decisões destino celular e as interacções célula-célula no epitélio do intestino. Devido à sua arquitetura simples e taxa de rotatividade rápida, Organóides representam um modelo ideal sistema para o estudo da biologia de células-tronco de adultos. Além transdução retroviral pode ser aplicada a Organóides derivadas de ratinhos transgénicos pré-estabelecidas, assim como amostras de pacientes humanos. Com a aproximação do knock-in e knock-out não pode ser estendido para os seres humanos, os Organóides humano SI constituem uma alternativa atraente. Em resumo, a manipulação genética por meio de transdução retroviral permite a análise fenotípica em pequenas Organóides intestinais derivadas de camundongos ou amostras de tecidos humanos, complementando assim a genética do rato e linhas celulares ao abrir novos caminhos para estudos em tecidos de origem humana. Transdução retroviral permite gain- e perda de função de estudos para ser executada no sistema de cultura organï¿½de 4. Isto o torna um recurso valioso para investigar a função do gene, a biologia de células-tronco adultas e doença estando em conformidade com os três Rs (redução, refinamento e substituição).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Células-tronco Lgr5-positivo pode ser complementado com o crescimento essencial fatores EGF, Noggin, e R-espondina, o que nos permite cultura cada vez maior estruturas epiteliais 3D primários in vitro. A arquitetura e fisiológicas propriedades desses &quot;mini-coragem&quot;, também chamados de Organóides, se assemelham os seus homólogos em vivo. Isso os torna um sistema modelo atraente para o pequeno epitélio intestinal. Usando transdução retroviral, genética funcionais podem agora ser realizadas por superexpressão de genes condicional ou knockdown. Este vídeo demonstra o processo de cultura organï¿½de, a geração de retrovírus, e a transdução retroviral de Organóides para auxiliar na análise fenotípica do epitélio do intestino delgado in vitro. Este sistema modelo organotípico romance, em combinação com a expressão de genes mediada retroviral fornece uma ferramenta valiosa para a análise rápida das funções de genes in vitro, sem a necessidade de costlGeração Y e demorado para animais transgênicos.

Organóides está pronto para ser dividida quando o lúmen central é escurecido devido à presença de células mortas (Figura 2). Depois de 2-3 dias de Organóides de pré-tratamento devem adotar uma morfologia cística redonda (Figura 3). Isto aumenta o número de células estaminais, aumentando as possibilidades de obtenção de integração estável. O tamanho do pelete do vírus pode variar após a centrifugação do sobrenadante viral, mais provavelmente, devido à variação de contribuição de restos celulares com o tamanho da pelota. Não foi observada correlação clara a eficiência de transdução. Durante o processo de selecção Organóides não transduzidas vai morrer, enquanto que os que tem uma integração estável permanecerá. A proteína fluorescente de retrovírus MSCV-eGFP pode ser observada em células originárias de Organóides sobreviventes, que têm uma morfologia cística, dentro de 2-3 dias após a transdução (Figura 4). <img alt<html> = &quot;Figura 1&quot; fo: Content-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 1 Uma representação esquemática do procedimento de transdução retroviral. Antes Organóides infecção são pré-tratados com ENRWntNic até adoptarem uma estrutura cística (passo 1). As células E-platina são utilizadas como a linha celular de empacotamento, e são cultivadas até atingirem uma confluência de 70-80%. Posteriormente são transfectadas com a construção retroviral usando PEI. Os vírus são recolhidos 2 dias mais tarde (passo 2). Organóides são tripsinizadas para obter fragmentos que contenham 1-10 células (passo 3), e, em seguida, são infectadas (passo 4). Seguindo spinoculation para aumentar a eficiência de infecção (passo 5), os fragmentos organï¿½de infectadas foram semeadas (passo 6) e 2-3 dias mais tarde para a selecção de clones positivos com a integração estável pode ser realizada (passo 7). &quot;Width =&quot; 1765fig2highres.jpg 500 &quot;/&gt; Figura 2 Imagem representativa de Organóides após 4-6 dias de cultura. O lúmen é preenchido com células mortas, fazendo parecer escuro. Organóides nesta fase estão prontas para serem passadas. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Imagem representativa de pequenos Organóides intestinais cultivadas em meio ENRWntNic por 3-4 dias. Os Organóides adotar uma morfologia cística. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 Imagem representativa de pequenos Organóides intestinais (a) que mostram a expressão do transgene viral (b, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> AdvaNCED DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 4 semanas </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic meio (por 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 2 semanas </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> Suplemento de B27 (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Suplemento N2 (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína (500 mm) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> rato de EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin rato (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R-espondina Conditmeio ioned </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a meio condicionado </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> A nicotinamida (1 M) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Transdução de forma (por 20 mL) </td></tr><tr><td colspan="2"> Prepare fresco </td></tr><tr><td> Meio ENRWntNic </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Polibreno (8 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR meio (por 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 4 semanas </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 +++ </td><td> 17,4 ml </td></tr><tr><td> Suplemento de B27 (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Suplemento N2 (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína (500 mm) </td><td> 50 ul </td&gt; </tr><tr><td> rato de EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin rato (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R-espondina meio condicionado </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mídia para células Platinum-E (para 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 12 semanas </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Soro Fetal de Bovino (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromicina (1 ug / ml) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Blasticidina (10 ug / ml) </td><td> 500 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Mídia composição for Advanced DMEM / F12 +++, médio ENRWntNic, médio Transdução, médio ENR e meio para as células Platinum-E.

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A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Este protocolo explica cultura organóide Lgr5-positve primário eo desempenho subseqüente de transdução retroviral. Isto permite que a sobre-expressão de Cre-indutível ou knockdown do transgene entregue e permite estudos funcionais a serem realizadas no novo em organotípica vitro sistema modelo.

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.5K visualizações.  University of Cambridge.  Este protocolo explica cultura organóide Lgr5-positve primário eo desempenho subseqüente de transdução retroviral. Isto permite que a sobre-expressão de Cre-indutível ou knockdown do transgene entregue e permite estudos funcionais a serem realizadas no novo em organotípica vitro sistema modelo. 

Vídeo: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Biologia

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Tempo real Análise do Perfil metabólico em<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas mouse Intestinal Crypt organóide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Apoptose indução e detecção em uma cultura primária de células intestinais de pepino do mar

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...