Este protocolo ajuda a entender o recrutamento espacial e temporal de proteínas de reparação de danos do DNA, levando em consideração a fase do ciclo celular. Para discriminação do ciclo celular, usamos PCNA com proteína fluorescente como um marcador da fase S, que contorna artefatos introduzidos por outros métodos de sincronização do ciclo celular. Isso combinado com micro-irradiação baseada em laser dá resolução espostel incomparável à cinética proteica de reparação de danos de DNA.
O sucesso na utilização rotineira do nosso protocolo baseia-se no conhecimento básico da imagem confocal. 24 horas antes da micro-irradiação, emplaque um total de oito por 10 para a quarta células em 500 microliters para um mililitro de mídia em um vidro de cobertura de quatro poços. Uma hora antes da micro-irradiação, troque o meio de crescimento regular com o meio de imagem contendo olaparibe ou um controle de veículo, como o DMSO.
Pelo menos quatro horas antes da imagem, ligue a câmara ambiental e os componentes do microscópio. Ligue o aquecimento, o fornecimento de dióxido de carbono e o regulador de umidade. Inicialize fontes de luz junto com as linhas de laser pelo menos uma hora antes de transferir as células para o microscópio.
Óleo o objetivo do microscópio e coloque um vidro de cobertura câmara sob o microscópio. Para selecionar células de fase S em uma população assíncrona, procure através do ocular para o padrão de localização exclusivo do PCNA marcado mPlum na fase S e selecione um campo de visão que tenha células de fase S suficientes para micro-irradiação. Defina a região de interesse para a micro-irradiação usando o software associado para inserir linhas binárias.
Para definir o número desejado de linhas e espaçamento, clique em binário, em seguida, selecione inserir linha, círculo e elipse para desenhar o número desejado de linhas, em seguida, converta essas linhas binárias em ROIs de estimulação clicando em ROI, mova-se binário para ROI, em seguida, clique com o botão direito do mouse em qualquer um dos ROIs e selecione o uso como ROI de estimulação S1. Coloque essas linhas no campo de visão para que elas passem pelo núcleo das células. Antes da micro-irradiação, para identificar os focos PCNA para análise posterior, tome uma imagem de maior resolução do campo de visão, definindo os parâmetros necessários na GUI compacta A1 LFOV e nas janelas da área de varredura A1 LFOV seguidas de apertar o botão de captura. Para configurar a micro-irradiação, abra a guia de estimulação ND e acesse a janela de horário para adquirir uma série de imagens de pré-estimulação e, em seguida, uma série de imagens pós-estimulação usando os scanners Galvano.
Configure três fases na janela de horários. Na coluna de aquisição e estímulo, selecione aquisição, estímulo e aquisição para as três fases, respectivamente. Para a fase de estimulação, defina S1 como o ROI.
Na janela Galvano XY, defina 100% de potência laser para a linha laser de 405 nanômetros e defina o tempo de moradia para micro-irradiação. Para configurar imagens timelapse para a janela de tempo e intervalos desejados, use o cronograma A1 LFOV compact GUI e as janelas da área de varredura A1 LFOV. Otimize a porcentagem de potência do laser, o ganho e as configurações de deslocamento para reduzir o branqueamento de fotos durante a imagem na janela GUI compacta A1 LFOV.
Dependendo da cinética da proteína, amplie ou encurte o intervalo entre as imagens ou a duração do timelapse total, definindo o intervalo e duração desejados para a linha de aquisição da terceira fase na janela de cronograma. Pressione executar agora para executar a micro-irradiação e a imagem de timelapse subsequente. No final da imagem timelapse, salve os ROIs de estimulação como imagens separadas, que serão úteis para identificar as coordenadas da micro-irradiação em qualquer software a jusante usado para análise.
O PCNA possui uma distribuição completamente homogênea no núcleo nas fases G1 e G2. Na fase S, o PCNA localiza-se em locais de replicação de DNA, que podem ser visualizados como pontos brilhantes no núcleo. Nas primeiras células da fase S, as manchas são relativamente pequenas e igualmente distribuídas por todo o núcleo da célula.
Enquanto avançam para a fase média S, as manchas ficam borradas e se localizam mais em direção ao perímetro do núcleo e do nucleoli. Na fase S tardia, as manchas reduzem em número, mas se tornam cada vez maiores à medida que o PCNA se concentra em locais de replicação tardios. Baixas doses de energia, como 1.000 microsegundos de tempo de moradia, não induzem o recrutamento de EGFP-FBXL10, um duplo break respondente encalhado, mas são suficientes para induzir o recrutamento de NTHL1-mCherry, uma proteína de caminho de reparo de excisão base que é recrutada para locais de dano oxidativo de DNA.
Aos 3.000 microsegundos, tanto o EGFP-FBXL10 quanto o NTHL1-mCherry são recrutados, demonstrando uma saída de laser que gera lesões oxidativas e quebras duplas encalhadas. EXO1b atinge um nível máximo de acumulação e micro-irradiação em torno de um minuto, e então lentamente começa a se desengajar das lesões de DNA. Na presença de olaparibe, o acúmulo de EXO1b na faixa laser em um minuto é significativamente menor se comparado ao controle do veículo.
É crucial que o microscópio tenha tempo suficiente para aquecer e que a cultura e as condições sejam ideais para cada experimento para garantir resultados consistentes. Além disso, é importante otimizar suas configurações de laser com diferentes repórteres de dano de DNA para testar lesões específicas de DNA. Após a microdiadistração, considere validar resultados com métodos bioquímicos clássicos, como fracionamento, imunoprecipitação ou ChIP.
Essas abordagens amostram uma população celular maior, proporcionando assim força estatística.
