Este protocolo permite uma determinação precisa da duração da fase S em células de levedura de brotamento sincronizadas. É um método rápido, fácil e reprodutível. Além disso, é sensível o suficiente para detectar defeitos leves de síntese não detectados pelos protocolos clássicos.
Este método será útil para muitos pesquisadores que trabalham na regulação do ciclo celular em leveduras em brotamento. Demonstrando esse protocolo estarão Nicolas Talarek, pesquisador sênior, e Juan De Dios Barba Tena, estudante de doutorado no laboratório. Inocular células de Saccharomyces cerevisiae em 10 mililitros de meio SC a uma baixa concentração celular para uma cultura noturna a 30 graus Celsius com agitação orbital a 130 rotações por minuto.
No dia seguinte, diluir as células em 20 mililitros de meio SC fresco a uma concentração final de duas a três vezes 10 para as seis células por mililitro. A 40 microlitros de um miligrama por mililitro de fator alfa diluído em água. Em seguida, cultura das células a 30 graus Celsius, com agitação orbital a 130 rotações por minuto durante uma hora.
Repita esta etapa uma vez. Visualize as células sob um microscópio de luz para monitorar a parada G1. Prossiga se mais de 90% das células exibirem um shmoo e as outras forem células arredondadas sem ponta.
Centrifugar as amostras durante três minutos a 1, 500 G.Em seguida, deitar fora o sobrenadante com a pipeta de vácuo e ressuspender as células em 20 mililitros de meio SC. Repita esta etapa uma vez. Colete um mililitro de células duas vezes a cada cinco minutos e prossiga para a rotulagem EDU.
Adicione 400 microlitros do fator alfa 30 minutos após a liberação. Transfira um mililitro da cultura celular para um tubo de microfuga de dois mililitros contendo um microlitro de 10 milimolares de EDU, misturado bem por inversão. Para discriminar as células positivas de EDU das células negativas de EDU em um Pi EDU fatos bivariantes, transfira outro mililitro de cultura celular para um tubo de microfuge de dois mililitros contendo um microlitro de DMSO.
Incubar por três a cinco minutos a 30 graus Celsius sob agitação em um banho de água agitado. Pare a reação adicionando 100 microlitros de etanol a 100%. Pellet as células por dois minutos a 10.000 G em um microfugo.
Remova o sobrenadante usando uma pipeta a vácuo. Ressuspeite a pastilha celular em 500 microlitros de etanol a 70% e misture bem por vórtice. Deixar as amostras à temperatura ambiente durante, pelo menos, uma hora a 20 inclinações por minuto num balancim de velocidade variável para permear as células.
Pellet as células durante dois minutos a 10 000 G numa microcentrífuga e eliminar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo. Lave as células duas vezes com 500 microlitros de etanol a 10% e PBS. Pellet as células durante dois minutos a 10 000 G numa microfuga e eliminar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
Ressuspeite o pellet em 200 microlitros de PBS contendo RNase A e Proteinase K.Incubar de uma a duas horas a 50 graus Celsius com agitação ocasional, ou durante a noite a 37 graus Celsius. Pellet as células durante dois minutos a 10 000 G numa microcentrífuga e eliminar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo. Lave as células com 500 microlitros de PBS.
Em seguida, elimine as células e descarte o sobrenadante, como demonstrado anteriormente. Ressuspeite o pellet celular em 200 microlitros de PBS com 1%BSA. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, elimine as células, descarte o sobrenadante, como demonstrado anteriormente, e ressuspenda o pellet em 300 microlitros de PBS contendo 1%BSA. Distribua as células em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. O primeiro deve consistir em 200 microlitros de cultura celular para a reação Click e o segundo tubo deve conter 100 microlitros de cultura celular para a coloração verde do sytox.
Em seguida, elimine as células e descarte o sobrenadante, conforme demonstrado anteriormente. Para coloração verde sytox, ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de PBS. Em seguida, dependendo da concentração celular, transfira de 10 a 30 microlitros para um tubo de citômetro de fluxo contendo 300 microlitros de mistura verde de sytox.
Sonicate as amostras duas vezes por dois segundos a uma amplitude de 40 a 50%Deixe no escuro até processar as amostras em um citômetro de fluxo. Para a reação Click, ressuspenda o pellet celular com 40 microlitros de tampão de corante azida recém-preparado. Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 60 minutos.
Pellet as células e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente. Em seguida, lave as células três vezes com 300 microlitros de etanol a 10% em PBS. Em seguida, ressuspeite as células em 100 microlitros de 50 microgramas por mililitro de iodeto de propídio em PBS e deixe por 10 minutos no escuro.
Dependendo da concentração celular, transfira 10 a 30 microlitros da suspensão celular para um tubo de citômetro de fluxo contendo 300 microlitros de 50 milimolares Tris HCl, pH 7,5. Sonicate duas vezes por dois segundos a uma amplitude de 40 a 50. Deixe as amostras no escuro até processá-las em um citômetro.
Leia as amostras verdes do sytox usando um laser azul de excitação a 488 nanômetros e um filtro de passagem de banda de 530 por 30. Leia as amostras de EDU Pi da Baviera em um gráfico de pontos usando um laser azul de excitação a 488 nanômetros e um filtro passa-passo de banda de 615 por 20 para o eixo X Pi, e um laser de excitação vermelho a 640 nanômetros, um filtro de passagem de 660 por 20 bandas para o eixo Y. Três populações de células foram observadas na análise do citômetro bivariante EDU Pi.
A 25 graus Celsius, aproximadamente 27% da população celular estava na fase G1, 29% na fase S e cerca de 44% na fase G2 mais M. Em células sincronizadas, a duração da fase S pode ser de cerca de 25 minutos com base no tempo em que o conteúdo de DNA mudou de um C para dois C no perfil do citômetro de fluxo verde do sytox. A marcação de pulso EDU determinou com precisão a duração da fase S.
15 minutos após a liberação, uma fração de células EDU positivas foi detectada, indicando o início da fase S. A progressão através da fase S foi vista pela nuvem celular movendo-se para cima e para a direita no gráfico Bavaria Pi EDU. Finalmente, aos 35 minutos da liberação, uma fração de células foi EDU negativa, mas com o dobro da quantidade de DNA indicando que a fase S terminou e as células estavam na fase G2 mais M.
Apesar da alta sincronia observada, algumas células terminaram a fase S 60 minutos após a liberação e a fase S foi completa para toda a população aproximadamente 65 minutos após a liberação. É crucial ter uma sincronização perfeita e evitar que as células entrem na segunda fase S. As células podem ser fotografadas com um microscópio onde a previsão da replicação do DNA nuclear pode ser monitorada e quantificada.
Esta técnica ajudará a identificar mutantes que têm defeitos leves da fase S, bem como defeitos de duração do ciclo celular.
