Agradecemos a membros do laboratório Wingert para discussões úteis do AKI biologia e técnicas de peixe-zebra, e Diep C. para compartilhar a sua receita de metilcelulose. Os autores também gostaria de expressar nossa gratidão aos membros do pessoal da Notre Dame Centro de Pesquisa Zebrafish para prestação de cuidados de manejo em curso excelente para a nossa colônia zebrafish. Financiamento da concessão da subvenção NIH-NIDDK DK083512, generosa e laboratoriais start-up de financiamento da Universidade de Notre Dame, apoiou este trabalho.

1. Procedimento de microinjeção para rotular o zebrafish pronephros epitélio do túbulo proximal Para este procedimento, usamos um sistema microinjeção (Harvard aparatos, PLI90), com ar pressurizado fornecido por um compressor de ar (Jun-Air, modelo 04/06), e aparelhos micromanipulador (Narishege partes MN151, IP3 e GJI) que são montada em um posto de estereomicroscópio (Nikon, SMZ-Zoom 645) como as instruções do fabricante por. Conjugados dextrano são prontamente endocytosed pelo túbulo proximal do néfron, permitindo rotulagem preferencial desta população de células epiteliais 9. <ol><li> Exposição ao azul de metileno pode acentuar a autofluorescência do saco vitelino e torna a visualização do néfron túbulos mais difícil. </li><li> Levantar os embriões fertilizados em 28,5 ° C para um ponto no tempo de desenvolvimento entre 48-55 horas após a fertilização (hpf). Esta é a fase ideal para realizar microinjeções larvas por causa da facilidade com que microinjeção intramuscular pode ser executada, e porque a função renal começa neste momento. </li><li> Remover o córion de qualquer zebrafish unhatched usando um par de fórceps bem. Enxágüe os restos do córion placa de Petri e encha o prato com 30 mL de solução modificada E3. </li><li> Prepare uma bandeja de injeção para os embriões. Nosso molde de injeção preferido é feito de 1,5% agarose/E3, em que depressões triangulares são formados de tal modo que o embrião pode ser posicionado dentro injectável. Para fazer o molde de injeção, nós flutuamos um molde de plástico com saliências em forma de cunha (descrito em detalhes anteriormente 11) em uma placa de Petri cheia com uma base de agarose 1,5%. </li><li> Prepare agulhas microinjeção de vidro puxando tubos capilares com um extrator de agulhas, como descrito no Livro Zebrafish 10. Em breve, puxe a tubos capilares de vidro, em seguida, utilize uma pinça de metal fina para cortar a ponta da agulha microinjeção de fazer uma ponta com uma ponta afiada durante a visualização da ponta da agulha sob um estereomicroscópio. Armazenar as agulhas corte coberto por uma placa de Petri e posicionados em massa de modelar para proteger a borda de corte e evitar o acúmulo de poeira. </li><li> Prepare a solução de injeção para rotular o túbulo proximal. Dissolver 40 kD dextran-fluoresceína conjugada (Invitrogen, D1845), na concentração de 1 mg / mL em água destilada. </li><li> Para anestesiar o peixe, adicionar 5 mL de 0,2% tricaina pH 7.0 para a placa de petri contendo as larvas do peixe em 30 mL de E3. Os peixes são anestesiados quando eles já não apresentam a resposta ao toque. É vital que os peixes são completamente anestesiados ou eles vão se contorcer em cima tentando injetá-las. </li><li> Transferir os peixes anestesiados com uma bandeja de molde de injeção usando uma pipeta de transferência de plástico. A posição do animal com a cabeça na parte mais profunda da depressão triangular bem, e em seu lado de tal forma que o tronco está apoiado ao longo do lado do bem angulado. </li><li> Executar microinjeção intramuscular. Carregar uma agulha de corte com 2-3 mL de dextran fluoresceína, e injetar o animal em um somito tronco com aproximadamente 1 nL de solução. Apontar para a parte superior do somito, e evitar a gema de extensão sac. Isso garante que os túbulos de néfrons não são mecanicamente interrompidos pelo processo de microinjeção. </li><li> Transferência de zebrafish injetado para uma placa de Petri limpa e adicione modificada solução E3. Enxágüe os animais 3 vezes com E3 fresca para remover todos os vestígios de tricaina. Cobrir a tampa da placa de Petri com papel de alumínio para fornecer a luz de proteção para o dextran, e devolver os animais aos 28 ° C incubadora durante a noite. </li></ol> 2. Ablação a laser alvo de células do túbulo proximal Para este procedimento, usamos um estereomicroscópio com epifluorescência para marcar animais com dextran marcado com fluoresceína brilhantemente túbulos proximal e selecionar esses para ablação laser. Então, nós usamos um sistema laser pulsado Micropoint (Instrumentos Fotônicos, Inc), que foi acoplada a um microscópio composto (Nikon Eclipse 80i com anexo de epifluorescência), e calibrado para uso como instruções do fabricante, para realizar a ablação néfron celular. Tivemos o maior sucesso na ablação de células usando um filtro que permite FITC o pesquisador para ver as regiões dos túbulos fluorescente sob iluminação de campo claro. Antes de este procedimento, prepare media imobilização para a ablação por dissolução de metilcelulose 1,5% em 0,02% tricaine/E3. Alíquotas loja de metilcelulose para uso imediato em temperatura ambiente, ou a 4 ° C para armazenamento de longo prazo. <ol><li> Anestesiar o peixe-zebra hpf 72 pela adição de 5 mL de 7,0 a 0,2% pH tricaina para a placa de petri contendo as larvas do peixe em 30 mL de E3. Os peixes são anestesiados quando eles já não apresentam a resposta ao toque. É vital que os peixes são completamente anestesiados ou eles vão se contorcer em cima tentar executar a ablação laser. </li&gt; <li> Examine os animais injetado sob a configuração apropriada fluorescentes e selecionar animais em que você pode facilmente visualizar os túbulos proximal. </li><li> Transferência de embriões selecionados para um prato separado contendo tricaina. Os animais podem ser anestesiados por até 30 minutos antes de realizar a ablação de células. Se você pontuação&gt; 15 animais, o retorno destes para um prato separado contendo E3 modificada fresco, enquanto se aguarda a ablação como cada célula ablação leva alguns minutos. </li><li> Para realizar a ablação, a transferência de um peixe-zebra anestesiados para uma pequena placa de Petri contendo 1,5% tricaina methylcellulose/0.02% por 2 minutos para lavar o embrião na mídia imobilização. </li><li> Em seguida, transferir o embrião para uma lâmina de vidro contendo depressão uma queda de 1,5% methylcellulose/0.02% tricaina. Suavemente a posição do animal com uma sonda fina de tal forma que seu lado ventral enfrenta o slide e no lado dorsal é voltada para cima. </li><li> Coloque o slide no palco microscópio compund, e foco no lado dorsal do animal. Realização da ablação das células do néfron em foco, pressionando o pedal. Você vai ver a dispersão da fluorescência como as células epiteliais são ablated renal (Figura 1A). </li><li> Suavemente transferência do animal ablated a um poço em um 12 bem-prato para cultura subseqüente. Lavar a E3 2-3 vezes para lavar a metilcelulose. </li><li> Após a injeção, elevar o animal ao ponto no tempo desejado e realizar a análise desejada conforme estabelecido técnicas histológicas e molecular de embriões zebrafish jovens (Figura 2). </li></ol> 3. Resultados representativos: Os dados que são mostrados na Figura 1 indicam a timecourse ablação. Após a injeção intramuscular com dextran-conjugados, o túbulo proximal é preferencialmente rotulados. Injeção de Dextran-FITC foi usado para rotular o rim para ablação a laser, e os animais foram ablated reinjetado com dextran-rodamina menos uma ablação timepoint adicionais a seguir para recriar a população túbulo proximal. Técnicas de análise de expressão como a hibridização in situ pode ser usado para analisar as mudanças em amostras fixadas em intervalo de tempo após a ablação única célula, como mostrado na Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: procedimento de ablação a laser é seguido de rápida regeneração do epitélio tubular (AC) Timecourse de alterações celulares durante e após a ablação a laser de túbulos larva zebrafish proximal no momento da ablação (dia 3, o painel A), ou um ou três. dia pós-ablação (dia 4, painel B, dia 7, painel C). (Top) esquemas mostrar a posição do néfron, com dextran-FITC (verde) e dextran-rodamina (vermelho), e (em baixo) imagens ao vivo de controle e laser-ablated (LA) néfrons. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2:. Análise da expressão gênica após a ablação a laser Após ablação a laser no dia 3, os embriões foram fixados e processados ​​por montar toda a hibridização in situ para detectar transcrições para slc20a1a, que marcam o segmento de túbulo convoluto proximal do néfron. (A) Um embrião de controle que não foi submetido a ablação a laser, (B) um embrião em que uma grande extensão do epitélio dos túbulos foi ablated, e (C) um embrião em que um intervalo curto de epitélio dos túbulos foi ablated. Linha preta indica a extensão do túbulo proximal em A para fornecer referência, linhas azuis indicam a extensão da ablação a laser em painéis BC, e * indica que o controle (não-ablated) néfron contralateral em painéis BC.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O peixe-zebra é um organismo modelo amplamente utilizado ao longo de muitos aspectos da ciência, cujas aplicações estão crescendo 6. O emprego do sistema de modelo peixe-zebra no estudo de doenças renais como AKI tem levado a importantes observações e continuará a ser um bom modelo para estudar lesão renal 7,8. Com um genoma que foi seqüenciado e muitos protocolos molecular no lugar, tornou-se cada vez mais fácil realizar pesquisas zebrafish sofisticado que utiliza modelos transgênicos, knockdown do gene e estudos misexpression. O peixe-zebra tem um ciclo de vida curto, com tamanhos geração grande e bem definida estágios de desenvolvimento. Além disso, os estágios embrionário e larval do peixe-zebra são praticamente transparente, fazendo estudos de imagem possível sem dissecção do organismo. Ao longo da fase embrionária e larval, o peixe-zebra tem um rim pronephric composto de duas néfrons, que permanecem visíveis durante estes timepoints desenvolvimento. Néfrons zebrafish pronephric são análogas em estrutura e função com os seus homólogos de mamíferos, tornando-se um bom modelo para estudos de insuficiência renal aguda 4,5. O rim é crucial para a sobrevivência dos seres humanos e outros vertebrados, servindo como o órgão que limpa o corpo de resíduos metabólicos líquido. Esta função cleansing repousa sobre a capacidade dos néfrons dos rins de filtrar o sangue, e em seguida, modificar o filtrado para coletar resíduos nitrogenados para a secreção e, simultaneamente, manter o equilíbrio de líquidos e eletrólitos. Néfrons são compostos de um filtro de sangue, túbulos epiteliais, e drenam para um duto. A integridade estrutural e funcional de todas as três partes é essencial para a função néfron. Vários insultos ao rim, incluindo a exposição à nefrotoxinas, isquemia, ou obstrução das vias do fluxo urinário podem resultar em AKI 1. A patologia da AKI é freqüentemente associada com 1,2 necrose aguda tubular. Estudos clínicos têm demonstrado que se seguiu insuficiência renal tem uma taxa de mortalidade que pode variar 7-80%, dependendo da causa e do contexto da falha renal. Entretanto, o diagnóstico rápido e reversão da causa subjacente da AKI é cada vez mais associados com a recuperação através da regeneração dos túbulos do néfron necrótico. Estudos de mapeamento recente destino têm mostrado que a população de células grandes que preenche os túbulos de néfrons danificadas são células epiteliais que se originam de adjacentes, áreas uninjured 12. Essas descobertas não eliminaram a possibilidade de que renal tronco / progenitoras células podem participar do processo, e relatórios independentes têm sugerido que células da medula óssea derivados podem contribuir para a regeneração renal 13. É claro que as investigações continuaram são necessários para melhor resolver as fontes celulares de regeneração do epitélio renal. Tanto a regeneração néfron e desenvolvimento compartilhar o fenômeno da muda em estado de celular entre os fenótipos mesenquimal e epitelial. Durante o desenvolvimento do néfron, as células progenitoras mesenquimais se diferenciam em um fenótipo estacionário, inerentes a uma membrana basal para formar o epitélio tubular 3. O fenômeno migratório especularam de células epiteliais após insuficiência renal aguda necessita de uma desdiferenciação em um fenótipo mesenquimal. Curiosamente, estudos recentes sugerem que as células mesenquimais nos rins danificados apresentam um perfil de expressão semelhante a uma célula mesenquimal durante o desenvolvimento 14. Vários relatórios têm detectado mudanças nas moléculas de adesão celular, proteínas, citocinas e quimiocinas. Após a mesenquimais proposta para a transição do epitélio, as células remontar sobre uma membrana basal tubular e reiniciar atividades epiteliais. Determinar os genes importantes neste processo continua a ser um tópico de pesquisa para o nosso laboratório e outros. Grande parte do trabalho para elucidar os fatores-chave neste processo a ser feito, mas um progresso significativo no campo tem sido anunciado pelo estudo dos efeitos da gentamicina. AKI e insuficiência renal causada pela gentamicina é relevante considerando a prevalência de compostos nefrotóxicos usados ​​na medicina 15. Usado como um tratamento para bactérias gram-negativas infecções bacterianas, a administração de aminoglicosídeos leva a lesão aguda em 10-25% dos casos. A droga causa uma infinidade de efeitos negativos no celular, em conjunto, resultando em apoptose ou necrose em muitas células tubulares. Estudos descobriram que a droga se ligam preferencialmente a um complexo formado por megalina cubulin e que está envolvido na endocitose. Estas moléculas são encontradas em abundância nas células epiteliais do túbulo proximal, embora eles não se limitam a expressão nestas células. Através de sinalização celular, resultando na indução do estresse oxidativo, liberação de vasoconstritores, a depleção de ATP celular, hipóxia, a inibição de fosfolipases, antibióticos gentamicina e similares causaapoptose e necrose em células epiteliais. Além disso, os antibióticos desencadear contração mesangial no sangue néfron filtro (glomérulo), resultando em uma queda na taxa de filtração glomerular e negativamente alterando a capacidade dos rins de filtrar o sangue. A produção de espécies reativas de oxigênio, moléculas imunoestimulador, e ativação de fosfolipases têm efeitos difusos no néfron, criando uma patologia catastrófico que leva à insuficiência renal aguda. Enquanto gentamicina e estudos similares aos antibióticos têm sido e continuarão a ser ferramentas importantes para a pesquisa de regeneração renal, falta-lhes uma precisão que pode ser útil no tratamento de questões certas. Nosso sistema de usar o peixe-zebra em conjunto com um método de ablação por laser descrito neste protocolo responde à necessidade de tal ferramenta de pesquisa tão precisa. Ablação a laser permite que os pesquisadores para induzir a destruição das células em áreas focais do túbulo renal, que vão desde um pequeno (2-3) e grandes (&gt; 50-100) populações, com uma precisão inigualável. Neste protocolo, utilizamos um método previamente desenvolvido de exposição ao dextran-conjugados preferencialmente rótulo populações túbulo proximal epiteliais. Alternativamente, linhagens transgênicas zebrafish que expressam a proteína verde fluorescente em uma ou mais regiões do túbulo poderia ser usado. Por exemplo, cadherin17: eGFP zebrafish transgênicos apresentam fluorescência forte em regiões do túbulo distal (embora fraco em populações proximal), e pode ser valiosa para estudos de regeneração em segmentos túbulo outros 16. A visibilidade do néfron permitirá lapso de tempo de gravação de vídeo de alterações celulares ao longo do tempo. Quando combinada com estudos de expressão gênica, como montar toda a hibridização in situ ou imuno-histoquímica, os pesquisadores podem detectar alterações moleculares no néfron ao longo do tempo. Tomados em conjunto, essas estratégias podem começar a formular uma compreensão mais dinâmica dos eventos que transpire quando as células epiteliais renais são destruídas. A ressalva importante de nosso modelo de ablação a laser é que ele pode recapitular aspectos parciais das condições fisiológicas que acontecem no AKI humana. A morte celular induzida por dano físico instantânea é diferente da cascata de eventos que leva à necrose das células, e como tal os fatores humoral nestes microambientes diferentes não podem ser idênticas. Além disso, existe evidência de apoptose induzida durante a lesão renal, e não se sabe se tais conseqüências transpire insulto a seguir com um laser. No entanto, assim como a cultura de células é uma ferramenta que as melhores respostas a algumas perguntas que necessitam de um ambiente altamente controlado, ablação a laser servirá como altamente controlada in vivo modelo de LRA. Como tal, os insights obtida a partir renal estudos ablação epitelial em zebrafish provavelmente vai promover a descoberta de conhecimentos fundamentais que podem ser aplicadas a investigações de outras lesões renais e potencialmente usada para criar um melhor diagnóstico em seres humanos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Pratos embrião </td><td> Falcão </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> Pinça de dissecção </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Agulhas de injeção </td><td> Sutter Intruments </td><td> BF100-50-10 </td></tr><tr><td> Ultrapura agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 kilodalton (kD) Dextran-fluoresceína </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> Pipeta de transferência de plástico </td><td> Samco Científica, Fisher </td><td> 204, 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaina </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Metilcelulose </td><td> Sigma </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> Slides depressão </td><td> Pescador </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12 bem-prato </td><td> Corning </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration

Lesão renal aguda (IRA) é caracterizada por altas taxas de mortalidade da deterioração da função renal por um período de horas ou dias que culmina com insuficiência renal 1. AKI pode ser causada por uma série de fatores incluindo a toxicidade isquemia, drogas de base, ou lesão obstrutiva 1. Isso resulta em uma incapacidade de manter a homeostase de fluidos e eletrólitos. Enquanto AKI tem sido observada há décadas, eficazes terapias clínicas ainda precisam ser desenvolvidos. Curiosamente, alguns pacientes com LRA recuperar funções renal ao longo do tempo, um fenômeno misterioso que tem sido caracterizada apenas rudimentally 1,2. Pesquisa utilizando modelos de mamíferos de AKI tem mostrado que os rins isquêmicos ou feridos nefrotoxina-experiência da morte de células epiteliais no néfron túbulos 1,2, as unidades funcionais do rim, que são compostos de uma série de regiões especializadas (segmentos) de tipos de células epiteliais 3 . Dentro de néfrons, a morte das células epiteliais é maior nas células do túbulo proximal. Há evidências que sugerem que a destruição das células é seguido por desdiferenciação, proliferação e migração de células epiteliais vizinhas, o que pode regenerar o néfron inteiramente 1,2. No entanto, há muitas perguntas não respondidas sobre os mecanismos de regeneração epitelial renal, que vão desde os sinais que modulam a esses eventos para razões para a grande variação das habilidades entre os seres humanos para regenerar rins feridos. O peixe-zebra larval fornece um excelente modelo para estudo da regeneração do rim epiteliais como seu rim pronephric é composto de néfrons, que são conservados com vertebrados superiores, incluindo mamíferos 4,5. Os néfrons de larvas de peixe-zebra pode ser visualizado com as técnicas de fluorescência por causa da relativa transparência do zebrafish jovens 6. Isso proporciona uma oportunidade única de célula de imagem molecular e mudanças em tempo real, em contraste com os modelos de mamíferos, onde néfrons são inacessíveis porque os rins são sistemas estruturalmente complexos internalizados no animal. Estudos recentes têm empregado a gentamicina aminoglicosídeo como um agente tóxico causador de estudo do AKI e insuficiência renal subseqüente: gentamicina e outros antibióticos foram mostrados para causar lesão renal aguda em seres humanos, e os pesquisadores formularam métodos para usar este agente para provocar danos nos rins em zebrafish 7 , 8. No entanto, os efeitos de toxicidade aminoglicosídeo em larvas do peixe são catastróficas e letais, que apresenta uma dificuldade quando se estuda a regeneração epitelial e função ao longo do tempo. Nosso método apresenta a utilização da ablação de células alvo como uma nova ferramenta para o estudo de lesões epiteliais em zebrafish. Ablação a laser dá aos pesquisadores a capacidade de induzir a morte celular em uma população limitada de células. Áreas que variam de células podem ser direcionados com base na localização morfológica, função ou até mesmo a expressão de um fenótipo celular particular. Assim, a ablação a laser vai aumentar a especificidade do que os pesquisadores podem estudar, e pode ser uma abordagem nova e poderosa para lançar luz sobre os mecanismos de regeneração do epitélio renal. Este protocolo pode ser amplamente aplicada a populações de células-alvo em outros órgãos no embrião do zebrafish para estudar lesão e regeneração em qualquer número de contextos de interesse.

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Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Lesão renal aguda (IRA) em seres humanos é um problema clínico comum causado por danos às células epiteliais que compõem néfrons nos rins, e AKI está associada com altas taxas de mortalidade de 50-70% 1. Após a destruição das células epiteliais, néfrons têm uma capacidade limitada de regeneração, embora os mecanismos e as limitações que orientam este fenômeno ainda são pouco compreendidas. Neste artigo de vídeo, descrevemos nossa técnica de ablação a laser alvo de células renais dos néfrons nos rins embrião zebrafish, ou pronephros. Nosso novo método pode ser utilizado para complementar a nefrotoxicidade induzida por modelos de LRA e obter uma compreensão de alta resolução da célula e alterações moleculares que estão associados com a regeneração epitelial no néfron rim.

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

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Biology

15.2K visualizações.  University of Notre Dame. Lesão renal aguda (IRA) em seres humanos é um problema clínico comum causado por danos às células epiteliais que compõem néfrons nos rins, e AKI está associada com altas taxas de mortalidade de 50-70% 1. Após a destruição das células epiteliais, néfrons têm uma capacidade limitada de regeneração, embora os mecanismos e as limitações que orientam este fenômeno ainda são pouco compreendidas. Neste artigo de vídeo, descrevemos nossa técnica de ablação...

Vídeo: Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogênese cortical: Transição do Avanços no Laboratório de terapias baseadas em células

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Gerados por computador Modelo Estímulos animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murino Procedimento de Transplante Renal

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Um sistema para a cultura de células epiteliais pigmentadas da íris para estudo da regeneração Lens em Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

A aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Medidas cálcio citosólico em células epiteliais renais por citometria de fluxo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...