Este protocolo expõe as células cancerígenas em uma suspensão a pulsos breves de estresse de tesoura de fluido para imitar certos aspectos de como as células cancerígenas metastáticas são expostas a forças hemodinâmicas enquanto estão no sistema circulatório. É uma técnica relativamente simples para aplicar pulsos breves de alto nível de estresse de tesoura de fluido. Ao tentar este protocolo, tenha cuidado com agulhas sem tampa e não dobre-as, pois isso mudará o estresse da tesoura de força aplicada.
Este procedimento pode produzir aerossóis, por isso use medidas de segurança adequadas. Para começar, solte 70 a 90% de células PC3 confluentes do prato de cultura tecidual aspirando o meio de crescimento e lavando o prato de 10 centímetros com cinco mililitros de PBS livre de cálcio e magnésio. Em seguida, aspire o PBS e adicione um mililitro de 0,25% de trippsina.
Pós-trippsinização, observe o desprendimento das células sob um microscópio invertido. Para inibir a trippsina, adicione cinco mililitros de meio DMEM/F12 contendo 10% de FBS. Em seguida, coloque a suspensão celular em um tubo cônico e determine a concentração celular e o número total da célula.
Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por três minutos, em seguida, aspirar o supernasal e resuspensar a pelota em um meio de cultura de tecido livre de soro. Corte em torno do fundo do tubo de poliestireno de 14 mililitros na linha de sete mililitros e coloque a suspensão celular mista no tubo de corte. Coletar separadamente amostras de controle estático das células antes da exposição ao estresse da tesoura de fluido para usar para a realização de ensaios.
Para expor a amostra restante da suspensão celular ao estresse da tesoura de fluidos, desenhe a suspensão celular em uma seringa de cinco mililitros e conecte uma agulha de meia polegada de calibre 30. Coloque e fixe a seringa com uma agulha sem tampa em uma bomba de seringa e defina a taxa de fluxo para alcançar o nível desejado de estresse de cisalhamento de fluidos. Execute a bomba de seringa e colete a amostra de corte no tubo de corte em um ângulo de aproximadamente 45 graus para reduzir a espuma.
Remova cuidadosamente a seringa da bomba de seringa e use alicate para remover a agulha, tomando cuidado para não tocá-la. Repita o procedimento até que a suspensão da célula tenha sido exposta ao número desejado de pulsos de estresse de tesoura de fluido. Realize ensaios de viabilidade com as amostras estáticas antes de expor as células ao estresse da tesoura fluida.
Para ensaios enzimáticos, transfira 100 alíquotas de microliter das amostras estáticas em duplicata em uma placa de 96 poços. Em seguida, colete 100 microliters de amostras após a exposição ao estresse da tesoura do fluido e coloque-as em uma placa de 96 poços. Adicione 20 microliters de uma solução de resazurina de 0,15 miligramas por mililitro para cada amostra bem e para poços contendo 100 microliters de médio porte.
Incubar as placas do poço na incubadora de cultura tecidual de 37 graus Celsius por duas horas, depois medir a fluorescência e a absorvância usando um leitor de placas e obter a porcentagem de células viáveis comparando o sinal médio de cada uma das amostras expostas ao estresse médio à estática. Da mesma forma, coletar alíquotas de amostras estáticas para realizar citometria de fluxo e ensaios clonogênicos, conforme descrito no manuscrito do texto. Na análise representativa, a viabilidade das células de câncer epitelial da biópsia sinópsica foi avaliada por meio da conversão de resazurina após expor as células a uma série de pulsos de estresse de tesoura fluida.
Embora cada linha celular exibisse diferentes perfis de resistência, não houve diferença significativa na viabilidade após 10 pulsos de exposição ao estresse da tesoura fluida. Linhas adicionais de células cancerígenas de uma variedade de origens teciduais demonstraram a viabilidade de mais de 20% após 10 pulsos de estresse de calha de fluidos, com exceção das células MIA PaCa-2, que mostraram uma viabilidade inferior a 10% devido à sensibilidade à destruição mecânica por estresse de calha de fluidos. Ao coletar a amostra estática antes de aplicar o estresse da tesoura dos fluidos, certifique-se de que a suspensão da célula é uma mistura homogênea.
Retire cuidadosamente a agulha com alicates e não dobre ou toque na agulha. Além de medir a viabilidade celular, pode-se avaliar mudanças na expressão genética, sinalização celular, proliferação e migração. Usando isso como modelo de exposição ao estresse da tesoura de fluidos, pode-se estudar tanto como as células cancerígenas resistem à destruição pelo estresse da tesoura de fluidos e avaliar os efeitos do estresse da tesoura de fluidos na biologia das células cancerosas.
Esta técnica tem sido usada pelo nosso laboratório e outros para explorar os efeitos do estresse da tesoura de fluidos nas células tumorais circulantes. Esses estudos têm demonstrado que o estresse da tesoura de fluido altera rapidamente as propriedades mecânicas das células cancerosas e que isso contribui para a capacidade das células cancerígenas de resistir à destruição pelo estresse da tesoura de fluidos.
