Este protocolo é significativo porque detalha como gerar rapidamente grandes quantidades de modelo de DNA para uso em reações livres de células de um pequeno fragmento genético recebido de uma instalação de síntese. A amplificação do círculo de rolamento pode gerar grandes quantidades de DNA mais rápido do que a clonagem tradicional. Assim, ele suporta um teste de construção de design de rendimento mais alto a partir de bibliotecas de DNA sintético.
Essas técnicas podem ter grande variabilidade inerente para novos usuários devido às muitas etapas e pequenos volumes necessários. Deve-se dar atenção cuidadosa à técnica, e a prática torna-se perfeita. Para começar, adicione todos os componentes de um kit PCR em um único tubo PCR.
Em seguida, adicione um microliter do fragmento genético resuspended. Homogeneize suavemente a mistura por vórtice em uma configuração média por cinco a 10 segundos. Depois de programar o termociclador de acordo com o protocolo do fabricante do kit, execute o PCR.
Após a conclusão do PCR, use um kit de limpeza PCR para purificar o DNA da mistura de reação. Em um tubo de 1,5 mililitro, adicione o tampão de ligação de DNA e a amostra pcr em uma proporção de cinco para um. Transfira esta mistura para a coluna de giro e centrífuga a 16.000 vezes G por um minuto.
Descarte o fluxo através. Adicione 200 microliters do tampão de lavagem de DNA à coluna e incuba-o à temperatura ambiente por um minuto. Centrifugar a coluna novamente e descartar o fluxo.através.
Lave a coluna mais uma vez com o tampão de lavagem de DNA, como demonstrado. Depois de descartar o fluxo da segunda lavagem, remova qualquer tampão restante centrifugando a coluna por mais um a dois minutos. Para elutar o DNA, transfira a coluna para um novo tubo de 1,5 mililitro.
Em seguida, adicione 46 microliters de água duplamente destilada na coluna. Depois de uma incubação de um minuto, colete o DNA no tubo por centrifugação. E quantificar o DNA purificado usando um espectrofotômetro.
Para digerir e circularizar o DNA, combine cinco microliters do buffer de reação necessário, 20 unidades da enzima de restrição hindiii e 45 microliters do DNA purificado em um tubo PCR. Com uma pipeta, homogeneize suavemente esta mistura. Em seguida, incuba-lo em um termociclador por 15 minutos a 37 graus Celsius.
Após a incubação ser concluída, o calor inativa a enzima HindIII incubando por 20 minutos a 80 graus Celsius. Em seguida, adicione cinco microliters de tampão T4 Ligase e 800 unidades de T4 Ligase ao DNA recém-digerido. Depois de misturar suavemente com uma pipeta, incubar a mistura por uma hora a 25 graus Celsius para realizar a reação de circularização.
Uma vez que a reação esteja completa, purifique o DNA usando um kit de limpeza PCR como demonstrado anteriormente. Então quantifique o DNA. Para realizar a amplificação do círculo de rolamento, combine todos os componentes de reação e um microliter do modelo de expressão circularizada purificada em um único tubo.
Homogeneize a mistura com uma pipeta e alíquota de 10 microliters da mistura em quatro tubos separados. Incubar os tubos a 30 graus Celsius por quatro a 18 horas, depois inativar a enzima incubando a 65 graus Celsius por 10 minutos. Após a inativação do calor, incentive a condensação na parte inferior do tubo incubando a 12 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, diluir a solução resultante adicionando 15 microliters de água duplamente destilada a cada tubo. Combine o conteúdo de cada tubo antes de purificar e quantificar o DNA como demonstrado anteriormente. Para realizar a reação sem células, adicione os vários componentes necessários em um tubo e dilua ao volume final desejado com água duplamente destilada.
Misture bem a solução ao pipetar metade da solução de 10 a 20 vezes. Transfira a mistura de reação em alíquotas de 15 microliter para os poços desejados na placa de microtítiter. Em seguida, sele a placa com um filme de vedação incolor para manter a umidade e evitar a evaporação.
Coloque a placa lacrada no leitor da placa e permita que a reação prossiga para a conclusão. Se expressar o gene BPN de subtilisina usando o sistema livre de células, alíquota 94 microliters de água duplamente destilada e um microliter de 10 micromolar PNA em uma placa de fundo plano, incolor 96 poços. Em seguida, adicione cinco microliters da reação completa sem células e leia a placa usando um conjunto de leitor de placas para medir a absorvência a 410 nanômetros a cada 20 segundos durante 10 minutos, mantendo uma temperatura de 25 graus Celsius.
A expressão da Superpastada GFP no extrato estelar BL21 DE3 usando apenas 3 microliters de DNA RCA não purificado em uma reação de 15 microliteres é comparável à do plasmídeo PJL1. Duplicar e triplicar as quantidades de modelo parece não oferecer nenhum benefício óbvio, sugerindo níveis já saturados do modelo a 3 microliters por reação. Por outro lado, parece haver um benefício para aumentar a quantidade de modelo RCA ao usar o extrato da célula de tensão embaralhada.
Proteínas que requerem temperaturas mais baixas ou tempos de dobra mais longos afetam o tempo necessário para completar todo o fluxo de trabalho. Por exemplo, o ensaio da subtilisina após quatro horas de expressão leva a um resultado fracassado, já que quatro horas não são suficientes para a maturação da subtilisina. No entanto, permitir que a reação continue até 16 horas leva a níveis detectáveis de subtilisina.
Todos os componentes precisam ser bem misturados para que este protocolo funcione com a máxima eficiência. Seguindo esses métodos, uma grande biblioteca de candidatos a proteínas pode ser gerada sinteticamente e, em seguida, expressa em rendimento suficiente para caracterização. Este método abriu o caminho para o nosso grupo desenvolver n C dois sensores que podem funcionar em extratos celulares, permitindo-nos caracterizar rapidamente a proteína protótipo.
Isso nos permitirá iterar de forma mais rápida e inteligente no design de proteínas de novos bio catalisadores e terapias.
