Neste vídeo, descrevemos um protocolo de imagem ao vivo gratuito para capturar imagens do modelo fungo aspergillus nidulans, usando técnicas de microscopia de luz transmitida. Usamos essas imagens para analisar e quantificar a cinética de crescimento de aspergillus nidulans em mídia líquida e sólida. Uma representação visual deste protocolo permite que os usuários se familiarizem com etapas significativas de captura de imagens e processamento de imagens de microscopia.
Um método comum usado para medir o crescimento fúngico filamentoso são dois esporos fúngicos inoculados em uma placa de Petri contendo ágar nutriente e para medir o diâmetro da colônia em desenvolvimento alguns dias depois. No entanto, essa abordagem não é sensível o suficiente para quantificar as diferenças de crescimento. Por isso, foram desenvolvidas medições de células únicas utilizando microscopia de lapso de tempo.
Essas medidas são capazes não apenas de fornecer resultados precisos e quantitativos, mas também de refletir a dinâmica de crescimento de diferentes células dentro de uma população. Além disso, essa abordagem visa compreender melhor os mecanismos moleculares envolvidos nas respostas de crescimento fúngico aos sinais endógenos e ambientais. Comece por despejar 15 mililitros de ágar de nutrientes líquidos em pratos petri.
Coloque a tampa na parte superior e deixe esfriar. Use radiação UV para esterilizar placas. Antes de escarar a tensão fúngica de interesse de um estoque, aqueça o laço nodulante no queimador de Bunsen até que esteja quente, esfrie o laço esfaqueando-o no ágar.
Vórtice do tubo e listrar o laço através da superfície do ágar meio mínimo complementado com as necessidades nutricionais adequadas. Incubar placas por dois a três dias a 37 graus Celsius. Usando um palito estéril, transfira um pequeno número de conidia tocando suavemente uma única colônia para placas de mídia completa.
Incubar placas por três a quatro dias a 37 graus Celsius. Conidia de aspergillus nidulans, são colhidas em um tubo de vórtice estéril de 1,5 mililitro, com 1,0 mililitro de água autoclave destilada contendo 0,05% de volume por volume, Tween 80, para reduzir o número de aglomerados de conidia. Uma versão modificada do método ágar invertido é usada para imagens de fungos filamentosos na superfície média do ágar.
Inicialmente localmente 10 alíquotas de microliter de suspensão conidial vigorosamente vórtice, aproximadamente duas vezes 104 células por mililitro em placas de Petri de 15 mililitros médio mínimo com um peso por ágar de volume. Incubar a cultura experimental de acordo com o estágio de desenvolvimento a ser investigado. Aqui incubamos por três dias a 30 graus Celsius.
Depois, corte um bloco de ágar contendo a colônia, usando um bisturi estéril. Aqui nós cortamos uma cunha de ágar na margem da colônia, invertemos e colocamos a fatia de ágar em um oito, bem slide. Transfira 10 alíquotas de microliter de suspensão conidial vigorosamente vórtice de aproximadamente duas vezes 10 na potência de quatro nos poços de um slide de poço contendo 200 microliters de meio mínimo com os suplementos apropriados.
Incubar para que o tempo e a temperatura sejam examinados cada vez. A escolha do microscópio depende do equipamento disponível. De qualquer forma, o microscópio configurado deve incluir um estágio invertido, uma câmara ambiental ou pelo menos uma sala com controle preciso da temperatura do ar.
Inicialmente pré-aqueça o termostato e a câmara de microscópio para estabilizar a temperatura desejada. Aqui nós definimos a temperatura em 30 graus Celsius. Ligue o microscópio, a potência do scanner, a potência do laser e o computador, e carregue o software de imagem.
Coloque o slide previamente preparado no estágio do microscópio e foco. Encontre campos de visão que contenham células isoladas, não sobrepostas, ou pelo menos não superlotadas, para facilitar as medições de crescimento durante a análise da imagem. Selecione a técnica de microscopia de luz transmitida a ser usada e ative o detector de luz transmitido, bem como detectores para fluorescência quando necessário.
Defina o microscópio para adquirir imagens nos intervalos de tempo desejados e iniciar a aquisição da série temporal. O carregamento, visualização e processamento de imagens é realizado com o software de imagem de código abertoJ Fiji. Comece importando as imagens para Fiji usando plugins por um formato.
Selecione o modo de cor padrão e a escala automática. A fim de visualizar um carimbo de tempo e uma barra de escala como sobreposição vá para análise, ferramentas, barra de escala. Defina os parâmetros desejados em relação à largura, altura, cor e localização da barra de escala.
Vá para imagem, propriedades, para exibir propriedades de imagem no software imageJ Fiji. Observe as informações do intervalo do quadro. Aqui usamos um intervalo de tempo de aproximadamente 15 minutos e pressionamos bem.
Em seguida, vá para imagem, pilhas, rotular e definir as informações corretas para o intervalo. Defina a localização do rótulo modificando X e Y.Defina a unidade de medição no texto de campo e pressione a visualização. Use a correspondência de histograma para correção de iluminação entre diferentes quadros, selecionando imagem, ajuste, correção de alvejante, correspondência de histograma.
Uma nova janela com iluminação corrigida aparece. Use o plugin MtrackJ em plugins, MtrackJ, para rastrear a ponta hignótica em crescimento Para adicionar a faixa, selecione o botão adicionar na barra de ferramentas e coloque o primeiro ponto na ponta hifana usando o clique esquerdo do mouse. A série de tempo passará automaticamente para o próximo quadro.
Para concluir o processo de rastreamento, clique duas vezes no mouse no ponto final ou pressione a tecla escape. Rolar a tabela de saída, a coluna mais importante para calcular o crescimento da ponta hignágica, é a velocidade em qualquer quadro. Medições seguras de faixa, adicionar arquivo, salvar como, ao formato de arquivo de sua escolha, por exemplo, CSV, importar o arquivo salvo em seu programa de planilha e calcular a visualização e outros testes.
Pressione o botão de filme para gerar um filme, tipo de cor RGB, contendo os quadros com as faixas desenhadas neles, que podem ser visualizados em qualquer reprodutor multimídia padrão. Seguindo este protocolo, capturamos e analisamos várias imagens correspondentes a diferentes estágios de crescimento e desenvolvimento do fungo filamentoso aspergillus nidulans. A figura mostra a comparação das medições de taxa de crescimento do Delta ngnA Delta da AzhAD Delta.
O delta ngnA Delta azhAD é uma cepa duplamente excluída em dois genes implicados na desintoxicação e assimilação do produto de caça tóxico L, como adicionado em dois ácidos carboxílicos. Mostra medidas estatisticamente significativas de menor taxa de crescimento em comparação com a cepa do tipo selvagem em culturas líquidas submersas. Essa diferença de crescimento não é detectável medindo a área da colônia dessas duas cepas em meio mínimo sólido.
A imagem viva de célula única e de longo prazo é de valor significativo no esforço para obter informações espaçais e temporais da dinâmica das proteínas celulares. Este protocolo também é adequado para a realização de imagens de células vivas de longo prazo. Aqui vemos a germinação da conidia co-expressando a proteína eisosômica do núcleo da GFP PilA e o mRFP histonen H1. Aqui apresentamos um protocolo para analisar cinética de crescimento fúngico de forma reprodutível e confiável sem a necessidade de qualquer experiência prévia de análise de imagem do usuário.
Este protocolo permite quantificação objetiva e precisa do crescimento fúngico.
