Agradecemos a Professor Hiraoka por enviar cepas. Reconhecemos o apoio da Fundação Gustafssons Goran eo Cancer Society suecas (2008/939).

1. Cultura de levedura de fissão <ol><li> Prepare Edinburgh Mídia Minimal (EMM) e sem ammoniumchloride EMM (EMM-N) 8. Para reduzir autofluorescência a solução de glicose não deve ser autoclavado, mas ao invés de filtro esterilizado usando um filtro de 0,2 mm e, posteriormente, adicionadas ao meio autoclavado. </li><li> Células de levedura de fissão vacinar recém-cultivadas em uma placa de ágar com rich media, YEA 8, em 3 mL de meio líquido EMM com glicose esterilizados filtro. Use tubos de 13mL com uma leve empurrada na tampa para garantir uma boa ventilação das células. Permitir que as células crescem, agitando-os com 225 rpm em 30 ° C. Manter as células de crescimento em fase log (1 X 10 6 - 2 x 10 7 células / mL) por 2 dias, contando-los usando uma câmara Bürker seguido por diluição adequada, todas as manhãs e à noite. </li><li> No dia do experimento certifique-se que células na fase log no início, 5 X 10 6 - 1 x 10 7 células / mL. </li><li> Morrer de fome tele células de nitrogênio durante 20 minutos do interruptor de mídia para EMM EMM-N mídia. Isto é feito através da colheita 3 ml de células em um tubo de 1,5 mL Eppendorf em uma centrífuga de bancada na rcf 1,5 máximo como centrifugação a uma velocidade mais rápida pode induzir uma resposta de estresse na levedura 9. Use a técnica de duplo giro, o que significa; primeiro giro por 2 min, depois vire o tubo de Eppendorf 180 ° e girar novamente para 1,5 rcf 2 min 10. Isso ajuda a recolher todas as células em um pellet no fundo do tubo. Lavar uma vez com EMM-N e depois dissolver o sedimento em EMM-N e incubar as células durante 15 minutos a 30 ° C a 225 rpm balançando e depois continuar com o ponto 2. Preparação de amostras. </li></ol> 2. Preparação de amostras <ol><li> ML 1,5 colheita de células em um tubo de 1,5 mL Eppendorf em uma centrífuga de bancada na rcf 1,5 máximo como centrifugação a uma velocidade mais rápida pode induzir uma resposta de estresse na levedura 9. Use a técnica de dupla fiação, Meaning; primeira rodada por 2 min, depois vire o tubo de Eppendorf 180 ° e girar novamente para 1,5 rcf por 2 min 10. Isso ajuda a recolher todas as células em um pellet no fundo do tubo. </li><li> Retire o sobrenadante, mas deixe 10-15 mL e ressuspender as células em meios de comunicação restantes. Alternativamente adicionar 10 mL de mídia fresco para ressuspender o sedimento celular. </li><li> Certifique-se de ter lâminas de vidro claro e tampa de vidro (Nenhum 1.5). Normalmente você não tem que limpá-los, mas certifique-se que eles não estão cheios de poeira. </li><li> Retire do freezer uma alíquota de uma solução estoque de 1mg/mL lectina que foi esterilizado por filtração. A solução lectina pode ser novamente congelado algumas vezes. A lectina é usado para corrigir as células de levedura na tampa de vidro. </li><li> ML lugar 5 de EMM com glicose esterilizados filtro no vidro objetivo. </li><li> Colocar 5 mL de solução de lectina no canto do vidro da tampa. Posteriormente, colocar 5 mL de cultura de células no mesmo canto, ou seja, a queda lectina. Mix pipetando algumas vezes e, em seguida, espalhar a cultura de células-lectina mix toda a tampa de vidro usando o lado longo da ponta da pipeta. Dependendo da densidade de sua mistura de células deixar tudo ou sugar o excesso de líquido no canto oposto da tampa de vidro. </li><li> Coloque a tampa de vidro, em cima, com um lado sobre o vidro do objetivo e do outro lado no banco. Deixe a tampa de vidro secar um pouco por alguns minutos. Ele não deve absolutamente ser completamente seco, mas não deve ser muito líquido no vidro. </li><li> Coloque a tampa de vidro com um anjo · aproximadamente 70 a partir do vidro objetivo pela queda de EMM. Deixe de lado a tampa de vidro de modo que ele vai cair de cima para baixo para a queda de EMM. </li><li> Para selar as bordas com graxa de silicone preparar uma seringa de 2 ml. Corte a extremidade mais larga de uma ponta de 200 mL e anexá-lo à seringa. Encha a seringa com cerca de 1 mL de graxa de silicone. A linha fina de silício é aplicado para as bordas da tampa de vidro delicadamente pushing o pistão da seringa. Agora você tem uma pequena câmara de crescimento de S. células pombe. </li></ol> 3. Microscopia <ol><li> Inicializar a microscopia de fluorescência, ligando a lâmpada de mercúrio / xenon, o microscópio eo computador. Coloque a câmara de crescimento de levedura no microscópio de fluorescência. Use um objetivo X 63 ou um objetivo X 100 com NA = 1.3 ou superior. Se um objetivo óleo é usado, acrescente o óleo. </li><li> Use o campo brilhante para encontrar as células e obter uma imagem nítida. </li><li> As configurações para a microscopia de fluorescência variar dependendo do fluorocromos utilizados para rotular as células de levedura e do microscópio. Nós usamos um microscópio Zeiss LSM confocal Microscópio Laser Scanning 700 com o Plano Apochromat-lens 63x de petróleo objetivo (NA = 1.4) com a configuração de digitalização de 16 linha média avião. O pinhole deve ser definido para 1-1,1 unidades Airy, que dá uma fatia óptica de 0,8 mm. Nós detectar GFP na Pista 1, usando o conjunto de filtro para Alexa 488 com um divisor de feixe de 582 nm, portanto, detecting comprimentos de onda entre 488 e 582 nm. Na Pista 2, usamos um conjunto de filtros ideais para mCherry usando um divisor de feixe de 578 nm, assim, detectar comprimentos de onda entre 578 e 600 nm. Isso significa que, tanto o Track 2 MRFP (SPB) e NM (mCherry) serão detectados. </li><li> Tome-se como muitas fotos necessárias para ser capaz de medir em 60 células diferentes para cada cepa. Normalmente, 15 fotos de campos de microscopia independentes são suficientes. Recomenda-se que uma câmara de um novo crescimento de células novas é feita se o seu tempo a microscopia exceder os 60 minutos. </li></ol> 4. Medição quantitativa de distâncias subcelulares <ol><li> Abra as fotos no programa Edição Zeiss Zen Light. Usando a ferramenta de medida medições a distância em M entre os fluorocromos diferentes em todas as células, onde todos os sinais estão no mesmo plano focal. Ajustar a intensidade de luz e contraste para identificar o centro do sinal fluorescente. Este protocolo simplificado usa apenas dois diferentes colours e, portanto, o SPB e NM estão no mesmo canal. O SPB é apontada por sua grande estrutura redonda no NM. Transferir as distâncias a uma folha de bloco de notas. Medida em pelo menos 60 células. Outros programas como o ImageJ também poderia ser usado para medir a distância, mas Zeiss Luz Zen é o preferido devido à sua maior resolução da imagem e da facilidade para fazer zoom in e out usando esse programa. Imagens em formato lsm inaugurado em ImageJ terá os dois canais em cima uns dos outros. Para fazer uma foto com os dois canais, primeiro separar os dois canais e depois fundi-los. Posteriormente a ferramenta de linha podem ser usados ​​para medir as distâncias, tal como descrito acima. </li><li> Compare as distâncias média ou mediana subcelulares entre as diferentes estirpes e tratamentos usando um programa de estatística, por exemplo, t-test ou Mann-Whitney Rank Sum Test, por exemplo, utilizando o software SigmaStat-3.5. Freqüentemente os dados não são normalmente distribuídos uma vez que haverá uma seleção para células com menordistâncias entre os sinais fluorescentes já que todos os sinais precisam estar no mesmo plano focal a ser medido. Um t-teste só pode ser usado quando os dados tem uma distribuição normal, enquanto uma Mann-Whitney Rank Sum Test permite a comparação de conjuntos de dados que a falta de distribuição normal. Em um t-teste a média de dois conjuntos de dados diferentes são comparados ao mesmo tempo em um teste de Mann-Whitney Sum Posição da mediana é comparado. </li></ol> 5. Resultados representante Strain PJ1185: (h + + his7:: dis1placR - GFP chr1 [:: + ura4 hphMX6 Laco] sid4-MRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 Leu1 ade6-DN / N) foi cultivado em EMM . A amostra foi retirada e montada em uma câmara de crescimento pequenas e fotos foram tiradas (Fig. 1A + N). Posteriormente, o meio de crescimento foi substituído por EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), e as células foram grown por 15 minutos agitando. As células foram então carente de nitrogênio montado em uma câmara de crescimento com EMM-N e fotos foram tiradas (Fig. 1A-N). A ferramenta de medição foi utilizado para medir a distância entre o locus (GFP) e do SPB (Fig. 1B e Tabela 1). Além disso, a distância entre o locus (GFP) e os NM foi medido (Figura 1B e Tabela 2). As distâncias mediana subcelulares antes e após a depleção de nitrogênio foram comparados utilizando o programa SigmaStat-3.5 software (Tabela 3). Houve uma mudança significativa na localização do cluster gene se afastando do NM para o PAS. Os dados que medem a distância entre o GFP eo PAS teve uma distribuição normal e, portanto, a distância média (1,777 M + N e 1.587 M-N) pode ser comparada usando uma t-teste (Tabela 1 e 3). Houve diferença significativa entre os dois valores médios (P = 0,008, t-test). Os dados que medem a distância entre a GFP e NM não tinha um di normaisstribution e, portanto, as distâncias mediana (0 mM + N e 0,390 M-N) foram comparados utilizando um teste de Mann-Whitney Rank Sum (Tabela 2 e 3). Houve diferença significativa entre os dois valores médios (P &lt;0,001, Mann-Whitney Rank Sum). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> Figura 1. A localização de um grupo de genes chamado chr1, marcado por GFP, mudou após a privação de nitrogênio. (A) Coluna da esquerda, + N, um núcleo de célula representante de uma célula criada em coluna da direita EMM,-N, um núcleo de célula representante de uma célula criada em EMM-N. Verde é o sinal de GFP rotulagem do cluster chr1, o vermelho é a MRFP mCherry e rotulagem do SPB e NM, respectivamente. (B) núcleo da célula mesmo que (A), mas agora com medidas distâncias subnuclear; amarelo: o diâmetro do núcleo da célula, azul: a distância entre SPB e sinal de GFP e rosa: a distância entre o sinal de boas práticas agrícolas ea membrana nuclear. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> Tabela 1. As distâncias medidas em subnuclear M da cepa PJ1185 cultivadas em EMM. Primeira linha, o diâmetro da célula (d), segunda linha, a distância entre o GFP eo SPB, terceira fileira, a distância entre o GFP eo NM. <img alt="Tabela 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="Tabela 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="Tabela 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> Tabela 2. As distâncias medidas em subnuclear M da cepa PJ1185 cultivadas em EMM-N. Primeira linha, o diâmetro da célula (d), segunda linha, a distância entre o GFP eo SPB, terceira fileira, a distância entre o GFP eo NM. <imgalt = &quot;Tabela 3&quot; src = &quot;files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg /&quot; /&gt; Tabela 3. Estatísticas descritivas das distâncias observadas subnuclear em tensão PJ1185 antes (+ N) e depois (-N) privação de nitrogênio. Primeira linha: número de células medido, segunda linha: diâmetro médio (d) linha, em terceiro lugar: diâmetro médio (d), diante linha: distância média entre a GFP e SPB, quinta linha: distâncias médio entre o GFP e NM.

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	<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li><li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li><li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li><li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li><li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li><li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes.">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li><li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cut11(+):+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li><li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network.">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li><li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast.">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li><li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li><li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li><li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy in yeast. , (2000).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+(Nobel+Lecture).">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li><li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection.">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Durante a última década o uso de imagens de células vivas para monitorar eventos celulares tornou-se cada vez mais popular. Tudo começou com o uso de proteína de fluorescência verde da água-viva Aequorea victoria e agora muitos fluorocromos diferentes estão disponíveis através de uma emissão de fluorescência espectro amplo de ciano (475 nm) para vermelho distante (648 nm) 11. Uma das grandes vantagens de imagens de células vivas por imunofluorescência é que as células não são fixados por formol ou etanol / acetona tratamento antes de microscopia, evitando assim possíveis artefatos do processo de fixação. Além disso, imagens de células vivas oferece a possibilidade de seguir células individuais e tirar fotos em intervalos freqüentes durante horas ou dias de incubação, tornando-se possível obter filmes de eventos celulares 12. Células de mamíferos têm a vantagem de ter um tamanho maior, com diâmetros de cerca de 100 mm, em comparação com a célula de levedura menor com um diâmetro de cerca de 3-4 emu; m. Por outro lado, a vantagem com o fermento é o genoma facilmente manipulado. Recombinação homóloga ocorre de forma muito eficiente em leveduras e é usado para fundir as proteínas de interesse para diferentes fluorocromos 3. Além disso, usando a integração de seqüências alvo Laco e posterior expressão da proteína GFP-LACR permite a detecção de uma parte específica do genoma dentro do núcleo da célula 2. Utilizando S. pombe células em microscopia tem vantagens adicionais, uma vez que são naturais organismos unicelulares que crescem com um tempo de geração rápido em condições de baixo custo de cultura de células. Além disso, S. pombe é um organismo modelo excelente eucarióticas já que tem metazoários genes homólogos. Uma das principais limitações desta técnica é autofluorescência na célula de levedura perturbar a detecção do sinal de verdade. Este problema pode ser superado usando mídia crescimento mínimo com glicose filtro esterilizado em vez de autoclavado. EmAlém células da levedura devem ser cultivadas por 2 dias na fase de log antes de montá-los. O protocolo aqui apresentado oferece um método relativamente simples, mas ainda não quantitativos para determinar a localização subcelular de proteínas dentro da célula de levedura. Também por tirar fotos em momentos diferentes que podemos seguir eventos celulares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Lectina </td><td> Sigma </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> Graxa de silicone </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de varredura a laser LSM 700 </td><td> Zeiss </td><td> LSM 700 </td><td> Microscópio confocal outras poderiam ser usadas. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3,5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3,5 </td><td> Qualquer software para análise estatística poderia ser usado. </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

Várias técnicas de microscopia estão disponíveis hoje, que pode detectar uma proteína específica dentro da célula. Durante a última década imagens de células vivas usando fluorocromos como Proteína Fluorescente Verde (GFP) diretamente ligado à proteína de interesse tornou-se cada vez mais populares 1. Usando GFP e fluorocromos similares a localizações subcelulares e os movimentos de proteínas pode ser detectada em um microscópio fluorescente. Além disso, também a localização subnuclear de uma determinada região de um cromossomo podem ser estudados usando esta técnica. GFP é fundida à proteína repressora Lac (LACR) e ectopicamente expresso na célula onde repetições em tandem da seqüência Laco foi inserido na região de interesse no cromossomo 2. O LACR-GFP se ligará à repete Laco e que a área do genoma será visível como um ponto verde no microscópio de fluorescência. A levedura é especialmente adequado para este tipo de manipulação desde homólogosrecombinação é muito eficiente e, assim, permite a integração orientada dos repete Laco e proteínas de fusão com GFP engenharia 3. Aqui nós descrevemos um método quantitativo para análise de células vivas de levedura. Protocolos adicionais para a análise de células vivas de levedura pode ser encontrado, por exemplo, sobre como fazer um filme dos 4 comportamento meiótico cromossômicas. Neste experimento em particular nos concentramos na organização subnuclear e como ela é afetada durante a indução de genes. Nomeamos um cluster gene, chamado chr1, pela introdução de sites Laco ligação na vizinhança dos genes. O cluster do gene é enriquecido para genes que são induzidos precocemente durante a fome de nitrogênio de levedura 5. Na linhagem da membrana nuclear (NM) é marcado pela fixação do mCherry ao Cut11 proteína NM dando origem a um sinal vermelho fluorescente. O eixo Pólo corpo composto (SPB) Sid4 é fundida a uma proteína fluorescente vermelha (Sid4-MRFP) 6 </sup&gt;. Em células de levedura crescendo vegetativamente os centrômeros estão sempre ligados ao SPB que está incorporado no NM 7. O SPB é identificado como uma grande estrutura redonda no NM. Por imagem antes e 20 minutos após o esgotamento da fonte de nitrogênio, podemos determinar a distância entre o grupo de genes (GFP) e NM / SPB. As distâncias médias ou mediana antes e após a depleção de nitrogênio são comparados e podemos, assim, quantificar se há ou não uma mudança na localização subcelular do cluster do gene após a depleção de nitrogênio.

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Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

A levedura de fissão,<em&gt; Pombe Schizosaccharomyces</em&gt;, É um sistema bom modelo para estudar os processos celulares básicos. Aqui nós descrevemos um método para realizar a análise quantitativa de células vivas de levedura. Neste experimento em particular nos concentramos na organização do genoma dentro do núcleo da célula, mas o método também pode ser usado para estudar os fatores citosólicos.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

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Biology

20.1K visualizações.  University of Uppsala. A levedura de fissão, Pombe Schizosaccharomyces, É um sistema bom modelo para estudar os processos celulares básicos. Aqui nós descrevemos um método para realizar a análise quantitativa de células vivas de levedura. Neste experimento em particular nos concentramos na organização do genoma dentro do núcleo da célula, mas o método também pode ser usado para estudar os fatores citosólicos.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologia

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Análise espacial e temporal da Cytokinetic Eventos na levedura de fissão

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...