Este protocolo é significativo porque demonstra como preparar nanopartículas poliméricas, ácidos nucleicos encapsulados em um passo simples. As principais vantagens dessa técnica, são a versatilidade, pois pode ser aplicada a diferentes ácidos nucleicos e tipos celulares. O uso de procedimentos simples para preparação de partículas, como tubulação para cima e para baixo, e a possibilidade de ampliar a estabilidade das nanopartículas e condições do tambor por liofilização.
No processo estarão Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto e Maria Navalon-Lopez, doutoranda do nosso laboratório e Marta Diaz-Caballero, pós-doutora do nosso laboratório. Para formação de poliplexes, descongele os polímeros previamente preparados, peptídeo C6, ésteres de poli beta amino e vórtice da solução. Depois de tubos a mistura de polímero para cima e para baixo, prepare uma solução de 12,5 milimiliar em acetato de sódio.
Vortex a solução e esperar por 10 minutos. Em seguida, prepare mRNA a 0,5 miligramas por mililitro e misturado por pipetação. Vórtice a solução de polímero novamente, em seguida, misture a solução de material genético na solução de polímero em uma proporção de um para um em um tubo de micro centrífugas e incubar o tubo a 25 graus Celsius por 30 minutos em um Thermoblock.
Após a incubação precipitar a mistura com uma a duas água livre de RNase adicionando a amostra a um tubo de micro centrífugas contendo a água, em seguida, para incluir os excipientes, adicione um monte de 20 mililitros e 4% solução de sacarose no mesmo volume que a mistura de ésteres mRNA e poli beta amino, e misturado por pipetação. Para lyofilização depois de congelar a solução de poliplex a menos 80 graus Celsius por uma hora, realize a secagem primária e, em seguida, armazene imediatamente os poliplexes a menos 20 graus Celsius para evitar a reidratação. Para a ressuspensão poliplex, remova as nanopartículas liofilizadas do congelador de menos 20 graus Celsius e adicione rapidamente a quantidade correspondente de água hidrogenada profunda para reestrugar o sólido e alcançar a concentração desejada.
Pipeta suavemente até a ressuspensão total e uma vez dissolvida, pipeta para cima e para baixo vigorosamente evitando bolhas. Após 24 horas de transfecção para avaliação qualitativa por microscopia de fluorescência, coloque a placa de 96 poços contendo as células Hela transfecidas no microscópio e comece a visualizar usando o objetivo de 10 vezes. Primeiro, aplique um balanço de branco para criar uma referência de fundo para o software e, em seguida, adquira uma imagem para sobrepor-a com a imagem de fluorescência durante a análise.
Altere o modo microscópio para modo de reflexão e mova a roda do filtro para o laser azul para visualizar o EGFP. Em seguida, adquira imagens para todas as condições ou poços que empregam o mesmo tempo de exposição. Para avaliação quantitativa por citometria de fluxo, lave as células Hela transfeccionadas em uma placa de poço 96 usando 100 microliters de PBS por poço.
Depois de aspirar o PBS a 25 microliters de trippsina por poço e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Uma vez que as células sejam separadas, adicione a mídia previamente recuperada para inativar a trippsina e, em seguida, fixe as células adicionando 31,25 microliters de 10% formalina por poço e incubando por 20 minutos. Em seguida, ligue o citômetro de fluxo e o software, em seguida, configure as condições adequadas para o experimento, incluindo o tipo de volume de amostra de placa e outros parâmetros, como agitação e lavagem entre amostras.
Configure os parâmetros apropriados para quantificar a porcentagem de células transfectadas positivamente, visualizando primeiro os dados de fluxo na luz dispersa dianteira versus luz dispersa lateral para distinguir as células dos detritos. E então plotando outra dispersão, comparando a amplitude versus altura ao portão e discriminar células individuais. Um dia antes da transfecção, placa 10.000 JAWS II células por poço em uma placa de 96 poços para incubação durante a noite.
No dia seguinte, transfem as células com 0,6 microgramas de mRNA por poço e incubam a placa por 24 horas em uma incubadora de ar seco a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, lave as células que permanecem no poço com 25 microliters de PBS. Depois de aspirar o PBS em 25 microlitrais de trippsina e incubar a placa por cinco minutos a 37 graus Celsius para desprender as células.
Pare a reação de trypsin adicionando a mídia recuperada anteriormente no correspondente bem. Em seguida, centrifuse a placa, aspire a mídia e fixe as células adicionando 50 microliters de PBS e 2,5% formalina por poço seguido pela incubação da placa a quatro graus Celsius por 20 minutos, centrifugar a placa. Em seguida, adicione 50 microliters de PBS e 3%BSA por poço e incubadora por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Após a incubação centrifugar a placa novamente, em seguida, adicione 50 microliters do anticorpo ovalbumin do rato em PBS e 3%BSA e incubadora por 30 minutos a quatro graus Celsius. Repita o passo de centrifugação e lave as células com 50 microliters de PBS. Depois de aspirar o PBS, adicione os anticorpos secundários e incubar por uma hora a quatro graus Celsius.
Após a incubação, repita as etapas de centrifugação e lavagem. Em seguida, resuspengue as células e 100 microlitres de PBS e 2,5% de formalina para análise de citometria de fluxo. Caracterização fisioquímica de nanopartículas encapsuladoras de GRNA de GFP frescas e liofilizadas não mostram diferenças significativas no tamanho e no índice de poli dispersão.
A microscopia eletrônica de transmissão dos poliplexes confirma a formação de nanopartículas esféricas e mono dispersas de aproximadamente 50 nanômetros de diâmetro. Os dados de eficiência de encapsulamento de um peptídeo Lego e poliplexes poli amino éster modificados encapsulando GFP, ou ovalbumin não mostram diferenças significativas dependendo do tipo de mRNA. Uma análise qualitativa da expressão EGFP, 24 horas após a transação na linha celular JAWS II é mostrada aqui.
Quantitativamente comparado ao controle negativo. A porcentagem de células positivas de GFP é significativamente maior e comparável a um controle positivo realizado com um reagente de transfecção clássica. O oligopeptida carregada ovalbumin mRNA e as nanopartículas poli-beta amino ér modificadas podem ativar células dendríticas, como visto pela expressão significativamente maior dos marcadores de membrana CD11b e CD86 em células transfeinadas em comparação com células não transfetadas.
Nossa plataforma de vacinação baseada no uso do mRNA como princípio ativo, bem como nossos polímeros proprietários podem ser adaptados para serem usados em profilaxia, bem como em terapêuticas contra o câncer. Podemos usar nossa tecnologia para destacar essa contribuição na imunoterapêutica do câncer. uma vez que podemos encapsular antígenos associados ao tumor em nossas nanopartículas e fazer uma mudança nos tratamentos de câncer.
