Este protocolo pode ser usado para prever e mitigar os efeitos adversos dos pesticidas sobre abelhas solitárias. A principal vantagem dessa técnica é simular a alimentação larval em pesticidas residuais em provisões. A demonstração visual desse método é fundamental porque as características biológicas da Escavada de Osmia são únicas em comparação com as abelhas sociais, e pouca pesquisa tem sido realizada na O.excavata, especialmente na larva.
Para preparar o tubo de alimentação, perfurar um orifício de 0,3 milímetros de diâmetro na tampa de um tubo de centrífuga de dois mililitros usando um ferro de enrolamento elétrico. Para preparar o pesticida, dissolva o pesticida de grau técnico em acetona para adquirir soluções de estoque de 10 miligramas por mililitro, em seguida, realizar diluições gradientes da solução para mais de cinco concentrações. Em seguida, adquira tubos de abelhas plásticas contendo provisões e larvas escavadas de Osmia recém-eclodidas de um programa de criação em massa.
Usando uma escova macia, retire suavemente a larva das provisões, selecione as larvas femininas com base no tamanho da provisão e posição celular dentro do ninho, em seguida, coloque as provisões de tamanho uniforme com a larva fêmea selecionada em placas de Petri de 60 milímetros de diâmetro e reserve-as para uso. Antes de prosseguir para o tratamento de pesticidas, pese as provisões. Para tratar as provisões com pesticidas, primeiro, meça o volume de solução de pesticidas.
Em seguida, mergulhe as provisões de tamanho uniforme selecionadas nas soluções de pesticidas diluídas por 10 segundos. Depois de tratar as provisões com o pesticida, meça novamente o volume das soluções de pesticidas. Depois de secar as provisões em uma mesa de trabalho estéril, adicione-as aos tubos de centrífugas preparados com furos.
Em seguida, pese 60 larvas fêmeas e usando uma escova macia, transfira as larvas para a superfície das provisões naturalmente secas, adicionando uma larva por tubo. Vire as larvas em uma câmara de crescimento no escuro a 25 mais ou menos dois graus Celsius com 65 a 75% de umidade relativa. Para o teste de toxicidade letal aguda, meça a mortalidade da larva após ser colocada no tratado e nas provisões de controle por 48 horas.
Em seguida, pesar as provisões restantes após 48 horas de criação de insetos para determinar a quantidade de provisão consumida por cada larva, em seguida, utilizando esta fórmula, calcular a dose de pesticida em cada concentração consumida por cada larva de acordo com a porcentagem de provisão consumida e o teor de pesticidas em cada provisão. Para o teste de toxicidade subletal, observe a O.excavata diariamente durante o casulo sob lâmpadas de luz negra para medir a duração do desenvolvimento larval. Em seguida, pese as larvas após 14 dias de tratamentos para determinar o ganho de peso larval.
Em seguida, pese as provisões remanescentes após 14 dias de alimentação para calcular o consumo e a eficiência da conversão de alimentos ingeridos. E examinar o número de eclosão cortando os casulos usando uma pequena tesoura quando as abelhas de controle emergem em adultos. O teste de toxicidade letal aguda mostrou que o valor de LD50 dos clorpirifos para as larvas de O.excavata foi de 0,001 microgramas por abelha.
No teste de toxicidade subletal, à medida que a dose aumentava, os valores de índice de ganho de peso larval, consumo e eficiência de conversão de alimentos ingeridos diminuíram para tratamentos, com os menores valores em relação ao controle observado nos 0,013 microgramas de clorpirifos por abelha. Por outro lado, a duração mais prolongada do desenvolvimento larval foi observada em 0,016 microgramas de clorpirifos por abelha, em comparação com o tratamento de controle. A avaliação do impacto dos clorpirifos na taxa de eclosão revelou uma relação linear negativa significativa entre as doses ingeridas de clorpirifos e a taxa de eclosão de O.excavata.
A taxa de eclosão foi consideravelmente menor quando as doses ingeridas ultrapassaram 0,02 microgramas por abelha do que as do tratamento de controle. Neste protocolo, a triagem para provisões de tamanho uniforme é fundamental para minimizar o erro do teste. Esta técnica é útil na exploração dos efeitos dos pesticidas no voo adulto e na fecundidade das abelhas solitárias, resolvendo assim problemas de baixa taxa de recuperação e declínio populacional.
