A microscopia de folhas de luz reticundo é uma poderosa tecnologia de imagem, mas poucos laboratórios no mundo são capazes de usá-la. Este protocolo fornece uma visão geral detalhada de como usar o microscópio de folha de luz disponível comercialmente. É um sistema extremamente poderoso capaz de imagens quadridimensionais de células individuais ou embriões que permite o rastreamento em tempo real de moléculas.
A principal vantagem desta técnica é que ela pode imagem tridimensional de células ou órgãos vivos únicos com alta resolução espesso e branqueamento mínimo de fotos. O padrão de rede da folha de luz nos permite amostras de imagens de alta velocidade e obter vídeos em tempo real de células vivas tridimensionais e órgãos com detalhes moleculares que outras técnicas não podem alcançar. Este primeiro protocolo de vídeo mostrando como para nós reticufato microscopia folha de luz para imagem única célula quatrodimensionalmente.
Esta é uma técnica muito complicada devido ao alinhamento e preparação da amostra. E acreditamos que a demonstração visual melhorará a acessibilidade, permitindo que mais cientistas visualizem muitas moléculas, células e órgãos diferentes na biologia. Para iniciar este procedimento, incubar tampas redondas de cinco milímetros com 0,1% de poli-L-lisina em temperatura ambiente por 10 minutos.
Aspire o líquido e deixe as tampas secarem naturalmente. Em seguida, adicione três mililitros de gradiente de densidade a um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione cuidadosamente as células à borda do tubo.
Centrifugar a 930 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, remova cuidadosamente a fina camada média das células entre a mídia completa e o reagente gradiente de densidade certificando-se de colocar cada tipo de célula em um tubo cônico separado. Centrifugar a 300 vezes g por cinco minutos para lavar as células.
Descarte o supernatante e adicione cinco mililitros de RPMI aos tubos de células T e células CH27. Repita a lavagem com RPMI fresco até que três lavagens totais tenham sido realizadas. Em seguida, resuspende as células em cada tubo com um mililitro de RPMI completo e conte as células com um hemótmetro.
Resuspend um milhão de células que apresentam antígeno em 500 microliters de RPMI completo e adicionar 10 MCC micromolar. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três horas. Depois disso, resuspense um milhão de células T em 500 microliters de RPMI completo.
Adicione dois microgramas de beta anti-TCR Alexa 488 rotulado FAB e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, centrifugar ambas as células a 300 vezes g por cinco minutos e descartar o supernante. Adicione 500 microliters de RPMI completo e repita a centrífuga para lavar as células.
Repita a lavagem com RPMI fresco até que três lavagens totais tenham sido realizadas descartando o supernatante após cada lavagem. Depois disso, resuspende ambos os tipos de células em 500 microliters de mídia de imagem. Primeiro, adicione 10 mililitros de água e 30 microliters de fluoresceína ao banho LLSM.
Pressione o Image Home para mover o objeto para a posição da imagem e olhar para um único padrão de raio laser Bessel. Alinhe o raio laser usando a região de interesse do guia e predefinido para tornar o feixe um padrão fino que é equilibrado em todas as direções. O feixe também deve aparecer focado na câmera do localizador.
Use os dois ajustadores de inclinação do espelho, o micrometro de foco superior e a cor objetiva para ajustar o feixe. Em seguida, lave o banho e os objetivos com pelo menos 200 mililitros de água para remover completamente qualquer fluoresceína. Para as contas fluorescentes padrão de imagem, ligue o dither configurando-se para três na caixa de alcance Xgalvo e pressione Ao Vivo para ver o campo atual.
Ajuste manualmente o espelho de inclinação, a cor objetiva e o micrometro de foco para os valores cinzentos mais altos. Em seguida, ajuste conforme necessário para obter padrões adequados para a varredura objetiva, Z galvo, Z mais modos objetivos e de captura de varredura de amostras. Depois disso, pressione Executar no modo de varredura de amostras para coletar a função de spread de ponto de amostra para desvasar e descompustion.
Mude os lasers para três modos de cor e pressione Execute novamente. Para começar, adicione 100.000 células anti-presentes ao deslizamento circular de cinco milímetros de diâmetro preparado e permita que elas se acomodem por 10 minutos. Unte o suporte da amostra e adicione a mancha de tampa ao lado da célula para cima.
Em seguida, adicione uma gota de mídia de imagem na parte de trás do deslizamento de cobertura. Enrosque o suporte da amostra no Piezo e pressione Image Home. Encontre uma célula de apresentação de antígeno à imagem e certifique-se de que o LLSM e o software de imagem estejam funcionando corretamente.
Pressione ao vivo para ver a imagem atual. Mova-se ao longo de Z para encontrar o deslizamento de tampas e células. Encontre o centro de uma célula que apresenta antígeno movendo-se na direção Z e pressione Pare para pausar o laser.
Verifique 3D e insira as configurações desejadas. Pressione o Centro de Pressão e pressione Executar para coletar os dados. Abaixe o estágio para a posição de carga e adicione 50 microliters de células T e mídia de imagem drop-wise diretamente sobre o deslizamento de fenda.
É melhor deixar uma forma de gota na ponta da ponta da pipeta e, em seguida, tocar a ponta para o líquido do banho. Levante o palco para trás clicando em "Retorno de Imagem". Comece a imagem.
Certifique-se de definir a pilha Z desejada e o comprimento do timelapse. Por exemplo, a imagem de 60 Z empilhia a um tamanho de passo de 0,4 micrômetro e entrada de 500 prazos. Pare de gravar antes que 500 quadros sejam alcançados para evitar branqueamento de fotos.
Use o modo ao vivo para procurar pares de células e, quando as configurações prontas e desejadas tiverem sido inseridas, pressione Executar para coletar dados. Neste estudo, as células T do mouse primário 5CC7 são isoladas e preparadas e são então imagens usando um microscópio de folha de luz de rede. Aqui estão mostrados o caminho correto do feixe e o alinhamento do feixe quando imagens com fluoresceína.
A varredura objetiva deve mostrar uma grande forma X nas projeções XZ e YZ que é o mais simétrico possível. Eles também devem ser ajustados para ser o menor de um X possível. O z galvo scan deve mostrar um oval em XZ e XY com um único ponto em ambos os lados.
Finalmente, tanto o Z mais o escaneamento objetivo e a amostra devem mostrar pontos que parecem o mais redondos possível. Usando este protocolo, a dinâmica quadridimensional dos receptores de células T em uma superfície de células T podia ser vista. A principal vantagem deste microscópio está na capacidade de rastrear as unidades de superfície visualizadas dos receptores de células T e obter dados quantificados de seu tamanho, movimento, intensidade de sinal e excreta.
A coisa mais importante a se lembrar é a qualidade do seu alinhamento. A folha de luz da rede deve ser alinhada diariamente e não fazê-lo corretamente resultará em imagens distorcidas. Da mesma forma, a qualidade do PSF coletado impacta diretamente na qualidade da descognição que, em última análise, resulta na qualidade de sua imagem final.
Uma das razões pelas quais esse método é tão poderoso é porque cada célula e rótulo pode ser substituído para visualizar muitos tipos e moléculas celulares. Portanto, este método pode ser usado para responder a qualquer pergunta relacionada ao rastreamento quadridimensional de moléculas. Acreditamos que essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores explorarem novas questões no campo do tráfico molecular.
Ele ainda não está sendo amplamente utilizado devido ao sistema complicado, então esperamos que este vídeo Jove melhore a acessibilidade à técnica. Os lasers usados no sistema são classe quatro, por isso deve-se ter absoluta cautela para garantir a segurança do laser. Por favor, faça o treinamento necessário de segurança a laser antes de usar este método.
