A fluorescência induzida por proteína única pode elogiar as medidas de FRET de molécula única ao estudar subpopulações e conformações estruturais proteicas, especialmente nos casos em que subpopulações estruturais distintas relatam estruturas estáveis. A principal vantagem desta técnica é que ela captura subsu populações estruturais específicas do local com base nas proximidades do local de rotulagem de corantes para as superfícies proteicas. O aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas únicas pode ser aplicado a qualquer sistema biomolecular de interesse para sondar subpopulações distintas, locais e estruturais.
Comece preparando 25 picomolars Sulfo-Cy3-rotulado alfa-sinucleína em tampão de medição em um tubo de ligação de baixa proteína. Adicione 100 microliters de um miligrama por mililitro BSA ao slide de cobertura de microscopia de 18 câmaras e incubar por um minuto, depois, descarte o BSA. Adicione 100 microliters de 25 amostras de alfa-sinucleína com rótulos de picomolar Sulfo-Cy3 na câmara do slide de deslizamento de cobertura.
Em seguida, para a aquisição de dados, adicione uma gota de água ultrauso na parte superior da lente objetiva de imersão de água de alta abertura numérica, corrija o deslizamento de deslizamento de tampa na câmara de palco e, em seguida, instale o conjunto na parte superior do estágio do microscópio. Leve a lente objetiva para cima até que a gota d'água em cima da lente objetiva esfregue na parte inferior do deslizamento de tampa e abra o obturador a laser. Quando a lente objetiva se mover para cima, inspecione o padrão dos anéis arejados em uma câmera CCD.
O primeiro anel representa o foco na interface água/vidro, e o segundo anel representa o foco na interface entre o vidro e a solução de amostra. Aumente a altura da lente objetiva em 75 micrômetros para trazer o foco a laser profundamente na solução para minimizar a autofluorescência da superfície de vidro do deslizamento da tampa. Sintonize a potência laser na lente objetiva aproximadamente 100, microwatts.
Inicie a aquisição dos fótons detectados por um tempo predefinido. Abra os Cadernos Jupyter e abra o caderno de amostras. Carregue o arquivo de dados FRETBursts e Photon-HDF5.
Use o histograma dos tempos interfotográficos para calcular as taxas de fundo para cada 30 segundos de aquisição de dados. Mova uma janela de tempo de um fóton de cada vez para 20 fótons consecutivos, e colete os dados do fóton se a taxa de fótons instantâneo F for pelo menos 11 vezes maior do que a taxa de fundo para esse período da aquisição de dados. Calcule o tamanho da explosão e a quantidade de fótons em uma explosão, a duração da explosão, a diferença de tempo entre o último e o primeiro tempo de detecção de fótons em uma explosão, o brilho da explosão, o maior valor da taxa de fóton instantâneo em uma rajada, e a separação da explosão, o intervalo de tempo entre rajadas consecutivas.
Plote o histograma dos valores de brilho estourado com o eixo de eventos em uma escala logarítmica. Defina o limiar de brilho da explosão como o valor mínimo de brilho da explosão a partir do qual o histograma exibe um padrão em decomposição, e seleciona as rajadas com valores de brilho maiores do que o limiar de brilho da explosão. Para a medição média da fluorescência, plote o histograma de nanotime de fótons para todos os fótons nas rajadas selecionadas com o eixo de contagem de fótons em uma escala logarítmica.
Defina o limiar de nanotime como o valor mínimo de nanotime a partir do qual o histograma de nanovezess de fótons exibe um padrão em decomposição. Selecione apenas esses fótons com nanovezes maiores que o limiar de nanotime. Calcule a média algébrica de todos os nanovezes de fótons selecionados.
Subtraia o limiar de nanotime da média algébrica de nanovezes do fóton. O valor obtido é o nanotime de fótons médio da explosão, diretamente proporcional à vida média da fluorescência. Traçar o histograma de todas as vidas de fluorescência.
As subpopulações distribuídas centralmente da vida fluorescência podem aparecer. As subpopulações com médias de menor valor representam as espécies moleculares com Sulfo-Cy3 que não foram obstruídas esticamente, enquanto as subpopulações com médias de maior valor representam a espécie molécula com S-Cy3 que foram mais obstruídas esticamente. Para a lenta avaliação dinâmica entre rajadas, plote o histograma dos tempos de separação de rajadas com um eixo de tempo de separação em escala logarítmica.
Selecione para salvar todos os pares das rajadas consecutivas que são separados por menos de um tempo máximo de separação que define a subpopulação da mesma molécula. Traçar um histograma ou uma dispersão das vidas médias de fluorescência da primeira e segunda rajadas para todos os pares das rajadas que se repetiram abaixo de um certo limite de tempo de separação. Os histogramas da fluorescência média de uma única molécula de fluorescência, rotulada por S-Cy3, mostraram que a primeira subpopulação teve uma vida de fluorescência característica de 1,6 nanossegundos, e representando estados conformacionais alfa-sinucleína com poucas superfícies proteicas nas proximidades do resíduo 56.
A segunda subpopulação teve uma vida fluorescência característica de 3,5 nanossegundos e representando estados conformacionais alfa-sinucleína com mais superfícies proteicas nas proximidades do resíduo 56. Os segmentos de componentes beta não amiloides das moléculas de alfa-sinucleína são conhecidos por adotar uma estrutura helicoidal, de grampos de cabelo ao vincular-se às vesículas de SDS, o que foi confirmado como uma única população de floresidade ao longo da vida com uma vida útil característica de aproximadamente três nanossegundos, e ausência da subpopulação com a vida útil característica de 1,6 nanossegundos. O histograma dos tempos de separação entre rajadas consecutivas de molécula única relata moléculas recorrentes para os tempos de separação mais rápido do que 100 milissegundos, onde a primeira e segunda rajadas surgem da mesma molécula.
O histograma médio de fluorescência ao longo de todas as explosões de moléculas únicas mostrou subpopulações com uma vida útil característica curta, bem como com uma longa vida característica, o que indica que moléculas individuais poderiam sofrer transições entre diferentes valores médios de vida mais lentos do que os tempos de duração da explosão. Dentro dos tempos de separação de 100 milissegundos, no máximo, houve uma fração de moléculas que começou como uma primeira explosão na subpopulação de curta duração, e se repetiu como uma segunda explosão dentro da subpopulação de longa duração. Enquanto a fração de moléculas que começou como uma primeira explosão na subpopulação de longa duração, e se repetiu como uma segunda explosão dentro da população de curta duração, indica as transições entre as duas subpopulações dentro de 10 a 100 milissegundos.
A coisa mais importante a ser lembrada ao analisar os resultados experimentais é separar corretamente sinais de fluorescência de moléculas únicas do fundo, e analisar rajadas com nanovezes de fótons suficientes. O desenvolvimento do smPIFE abriu o caminho para os pesquisadores explorarem interações de proteínas nucleicas de ácido no nível de molécula única. Esse avanço estabelece o terreno para o estudo da dinâmica estrutural local dentro das proteínas.
