A EHNA é uma das mais importantes doenças hepáticas crônicas do mundo. Pode evoluir para fibrose, cirrose e, eventualmente, câncer de fígado. Estudar a alteração dinâmica da MEC na EHNA pode ajudar a entender melhor a fibrose.
Tradicionalmente os exames de imagem não conseguem demonstrar alterações estruturais da MEC 3D, limitando a compreensão do processo de remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática. Para começar, pese o mouse antes do procedimento. Após anestesiar o camundongo, raspe a área ventral com um cortador de cabelo e desinfete a pele com etanol 70%.
Coloque o mouse nas costas e imobilize as pernas na prancha cirúrgica com fita adesiva. Use tesoura Mayo e pinça Adson para fazer uma incisão de três centímetros lateralmente no abdômen inferior. E então uma incisão de cinco centímetros verticalmente do abdome baixo para o processo xifoide sem abrir a cavidade torácica.
Após a abertura do peritônio, coloque suavemente os intestinos à esquerda do animal e eleve o lobo direito do fígado com um aplicador com ponta de rayon para expor a veia porta. Para cateterizar a veia porta, induzir um cateter IV de calibre 24 na extremidade distal da veia porta. Coloque a ponta do cateter antes que a veia porta se ramifica para os lobos hepáticos.
Retire a agulha imediatamente quando o cateter entrar na veia. Verifique se o cateter está corretamente posicionado dentro da veia perfundindo o fígado com PBS usando uma seringa de um mililitro através do cateter. Utilizar micropinça Dumont, microagulha Castroviejo e sutura 4-0 para colocar um ponto abaixo da ramificação da veia porta e um segundo ponto um centímetro abaixo para fixar o cateter.
Conecte o cateter a um tubo de silicone de um metro de comprimento, três milímetros de diâmetro interno e 4,1 milímetros de diâmetro externo com um conector de isca. Conecte a tubulação de silicone a uma bomba peristáltica e a um reservatório contendo água deionizada. Remova cuidadosamente as bolhas de ar dentro do tubo e evite gerar novas bolhas durante a perfusão.
Ajuste a bomba peristáltica a uma saída de fluxo de 0,2 mililitros por minuto. Examine primeiro com água deionizada por duas horas e a cor do fígado mudará de vermelho para amarelo durante a perfusão. Troque a solução de perfusão para desoxicolato de sódio a 0,5% e continue durante a noite e o fígado ficará branco no final da perfusão.
Troque a solução de perfusão por água deionizada e perfunda por duas horas. Use micropinças Dumont e tesouras de mola micro para coletar o fígado descelularizado e lavá-lo cuidadosamente em uma placa de Petri com PBS. Transfira um pequeno pedaço de fígado descelularizado para uma lâmina de microscópio e coloque o tecido no meio.
Adicione 10 microlitros de meio de montagem antifade ao tecido com uma pipeta para evitar o ressecamento do tecido. Cubra o tecido com um vidro de cobertura e aplique uma pequena força para achatar a amostra. Sele as bordas do vidro da tampa com esmalte incolor e transparente.
Coloque uma gota de óleo de imersão na parte superior do vidro da tampa e coloque a lâmina no suporte da lâmina do microscópio. Abaixe a lente objetiva de óleo 20X até entrar em contato com o óleo de imersão. Mude para o canal violeta de comprimento de onda de 405 nanômetros.
Ligue o obturador e concentre a amostra. Navegue e posicione a área de interesse para geração de imagens. Desligue o obturador antes de passar para a aquisição de imagens usando luz laser.
Para iniciar o laser de dois fótons, alterne para o controle do computador e ligue o laser de dois fótons primeiro. Em seguida, ligue o controlador de laser de dois fótons e o obturador, garantindo que a potência de saída seja superior a 2,5 watts. Reduza a potência do laser para evitar a têmpera da fluorescência.
Selecione e ajuste os detectores, tanto os multiplicadores de fotos quanto o híbrido para acomodar os fluoróforos escolhidos. Escolha aquisições de imagens simultâneas ou sequenciais. Ajuste o orifício para o valor mais alto.
Ajuste os comprimentos de onda do laser, ganho, potência, deslocamento do tempo de permanência do pixel, média do tamanho do pixel e zoom. Role o controlador Z do computador e defina as dimensões Z. Defina os pontos de início e fim e escolha os números de imagens fornecidos dentro de um volume.
Adquirir imagens. Após a realização da microscopia dos dois fótons, as fibras colágenas sem descelularização revelaram uma imagem de baixa resolução da rede colágena. Na matriz extracelular decelularizada, diferenças aparentes foram observadas na morfologia e distribuição espacial entre fígados de ração e dieta fast food.
Fibras colágenas e camundongos em dieta com ração exibiram uma rede entrelaçada e bem organizada, enquanto os camundongos em dieta fast food apresentaram feixes de colágeno com menor conectividade. A estrutura tridimensional da matriz extracelular hepática mostra que as fibras colágenas em camundongos na dieta chow mostraram uma rede bem organizada, mas não em camundongos dieta fast food. Para confirmar a qualidade do colágeno fibrilar na matriz extracelular decelularizada, as lâminas foram coradas com Hematoxilina Eosina e Picrosirius red.
A hematoxilina e a eosina mostram que todas as células foram removidas. Nas imagens de coloração vermelha do Picrosirius, a matriz extracelular dos camundongos alimentados com ração revelou uma rede bem organizada. E, em contraste, camundongos em dieta de fast food mostraram fibras de colágeno mais densas.
Remova cuidadosamente a bolha dentro de um tubo antes da perfusão. A bolha bloqueará o vaso no fígado e afetará a perfusão.
