O protocolo foi desenvolvido para a produção de variantes de huntingin de comprimento total a uma escala de miligramas baixa. Permite proteínas consistentes de alta qualidade, essenciais para os investigadores da DH. Demonstrando o procedimento estará Michael Harris, um cientista pesquisador do Laboratório Curia.
Comece adicionando um grama de polietilenoimina 25 K a um litro de água livre de endotoxinas e mexa bem. Ajustar o pH a 2,0 utilizando ácido clorídrico 100 milimolares e mexer até que toda a polietilenoimina se dissolva. Em seguida, ajuste o pH para 7,0 usando solução de hidróxido de sódio 100 milimolares e passe a solução através de um filtro de 0,2 micrômetro.
Faça alíquotas da solução filtrada e armazene-as a menos 20 graus Celsius. Propagar células HEK293 no meio de crescimento suplementado com estreptomicina de penicilina em uma incubadora agitadora umidificada a 37 graus Celsius, 90 RPM, 5% de dióxido de carbono por 18 a 24 horas. Um dia antes da transfecção, diluir as células a uma densidade de cerca de 1,2 x 10 até a sexta célula de potência por mililitro em dois litros de meio de crescimento em um frasco de Erlenmeyer de cinco litros e incubar por 18 a 24 horas.
No final da incubação, meça a densidade e a viabilidade celular usando um contador de células automáticas seguindo as instruções do fabricante. Após o cálculo da quantidade de polietilenoimina e plasmídeo necessários para a transfecção, diluir a polietilenoimina e o plasmídeo individualmente em 100 mililitros de PBS e incubar à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, misture o plasmídeo diluído e a polietilenoimina rodopiando suavemente e incube a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos.
Adicione a mistura à cultura de células e misture rodopiando suavemente. Agora, permita que as células cresçam por 24 horas. No dia seguinte, adicionar solução de butirato de sódio a uma concentração final de agente antiaglomerante e antiespumante de dois milimolares na proporção de volume de 1:1.000 para a cultura e incubar as células na incubadora do agitador umidificado por 48 horas.
Depois de medir a viabilidade e a densidade celular, colher as células por centrifugação a 2.000 G por 30 minutos e armazenar o pellet celular a menos 80 graus Celsius antes da purificação. Para a purificação anti-FLAG utilizando FPLC, embalar 12 a 25 mililitros de resina anti-FLAG numa coluna vazia a um caudal de quatro mililitros por minuto utilizando o tampão A e ajustar a altura do êmbolo para remover o espaço entre a extremidade do êmbolo e o leito de resina. Em seguida, suspenda o pellet de célula descongelada em tampão de lise frio e passe a suspensão celular uma vez através de um homogeneizador de alto cisalhamento a 1.000 libras por polegada quadrada de pressão.
Usando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo compatível, esclareça o lisado a 20.000 G por uma hora. Programe o FPLC na janela Método, carregue o lisado clarificado através da bomba de amostra e lave a coluna com os volumes de coluna desejados de buffer A, B, C, D e buffer de eluição conforme descrito no manuscrito do texto. Quando a execução estiver concluída, analise 10 microlitros das frações de pico usando SDS-PAGE.
Combine as frações de pico com a pureza desejada e economize aproximadamente 50 microlitros dos eluídos combinados para uma análise adicional do SDS-PAGE. Comece a equilibrar a coluna SEC usando o FPLC e carregue o eluído anti-FLAG através de um superloop de 50 mililitros. Depois de executar o buffer da SEC, permita que a separação da SEC ocorra durante a noite a quatro graus Celsius.
Compare o perfil de eluição com o perfil de eluição HTT padrão para distinguir os picos de monômero, dímero e oligomérico de ordem superior. Agrupe as frações monoméricas de HTT com base no perfil de eluição da coluna SEC e, se desejado, agrupe as frações HTT oligoméricas e diméricas de ordem superior separadamente. Concentre a proteína HTT agrupada usando um concentrador centrífugo de 100 quilodaltons a quatro graus Celsius.
Após o cálculo da concentração de proteína, alíquota inferior a 100 microlitros da proteína HTT purificada em um tubo de microcentrífuga crio-seguro. Congele as alíquotas usando nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Execute todos os SEC-MALS analíticos a quatro graus Celsius no sistema de HPLC, juntamente com um detector UV, um detector de dispersão de luz multi-ângulo, um detector de índice de refração diferencial e use 0,185 como o incremento do índice de refração para HTT.
Limpe a bomba e os detectores com água filtrada de grau HPLC e conecte a coluna UHPLC ao sistema. Equilibre a coluna com água filtrada e, em seguida, o buffer SEC-MALS até que todos os sinais do detector atinjam a linha de base. Injete dois microlitros de solução de BSA a uma taxa de fluxo de 0,3 mililitros por minuto durante 15 minutos por injeção.
Inspecione a qualidade dos dados, execute a normalização, o alinhamento de pico e a correção de ampliação de banda com base no perfil BSA e crie um modelo para as seguintes execuções de amostra HTT. Descongele rapidamente um frasco para injetáveis da amostra FL Q23-HTT num banho de água à temperatura ambiente utilizando um flutuador. Filtre o HTT através de um filtro de rotação de 0,1 micrômetro.
Injete de dois a quatro microlitros da amostra de HTT e corra por 15 minutos a quatro graus Celsius a uma taxa de fluxo de 0,3 mililitros por minuto. Analise os dados cromatográficos e de dispersão de luz usando o software de acompanhamento e gere um gráfico de Zimm para determinar a massa molecular média de peso para cada pico. No presente estudo, utilizando um processo de coluna de duas etapas, obteve-se maior que 95% de pureza para HTT e o principal contaminante foi a chaperona Hsp70, que foi eliminada por lavagem extensiva com cloreto de magnésio e ATP durante a etapa de purificação por afinidade anti-FLAG A superexpressão de FL HTT pode resultar em fragmentação da proteína, mas FL Q23-HTT produzida pelo método resolvida como uma única banda com o peso molecular correto de 350 quilodaltons indica que não há fragmentação.
A análise de Western blot após a reação de anticorpos com FL Q23-HTT demonstrou que a proteína foi isolada sem truncamentos detectáveis significativos, uma vez que não foram observadas bandas adicionais relacionadas a fragmentos. FL HTT poli-Q comprimento variância, Q23, Q48 e Q73 reagiu como esperado em Western blot, mostrando um sinal progressivamente mais forte para o anticorpo monoclonal poli-Q dirigido MW1, correlacionando-se com o aumento do comprimento Q. Entre as colunas de HPLC testadas, a coluna SEC mostrou resolução suficiente entre o monômero HTT e o dímero, de modo que as massas molares puderam ser distinguidas.
FL HTT purificado da SEC mostrou múltiplas bandas correspondentes aos estados de oligomerização, o que pode ser devido à presença de várias manchas hidrofóbicas que contribuem para a formação de oligômeros de ordem superior durante a migração dentro do gel. O HTT purificado mostrou três bandas principais em PAGE nativo azul com um peso molecular estimado de 643, 927 e 1.070 quilodaltons que provavelmente representam as espécies monomérica, dimérica e trimérica de HTT, respectivamente. O manuseamento adequado da huntingtina purificada é essencial para evitar a geração de oligômeros de alta ordem em agregados solúveis.
É imperativo que o usuário final trabalhe rapidamente para distribuir a amostra em tubos pré-resfriados antes do congelamento instantâneo. Testes de estabilidade a longo prazo podem ser realizados em amostras armazenadas em períodos prolongados a menos 80 graus Celsius. A repetição das análises HPLC SEC-MALS confirmará se houve alguma alteração no conteúdo monomérico da amostra.
