Este trabalho foi apoiado financeiramente pelas subvenções K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) e P01GM107012 (KWM) dos Institutos Nacionais de Saúde, e por fundos do Roy J. Carver Departamento de Bioquímica, Biofísica e Biologia Molecular da Universidade de Iowa . O conteúdo desta obra é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NIH.

Este protocolo é suficiente para a expressão usando HEK293F ou células HEK293S. 1. Estabelecimento celular <ol><li> Cultura Inoculação Nota: Todos os procedimentos de manipulação de cultura deve ser realizada em uma facilidade BSL-2 e cada item trazido para o gabinete de biossegurança devem ser esterilizados por pulverização com um 70% de etanol em solução aquosa. <ol><li> Operar o agitador a 135 rpm incubadora, 80% de humidade e a 8,0% de CO2 e 37 ° C. &quot;Ligar&quot; a lâmpada UV da cabine de segurança biológica, pelo menos, 1 h antes do trabalho. Pré-aquecer as garrafas de meio A e Meio B selados colocado no banho de água a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Esterilizar frascos de 125 ml de crescimento Erlenmeyer com uma tampa ventilada, pipetas, pipetas e frascos de mídia pré-aquecido por pulverização com o etanol a 70% em solução de água. Coloque esses itens no gabinete de biossegurança. Nota: Esterilizar somente no plástico exterior cobrindo a garrafa de cultura de 125 ml Erlenmeyer, e em seguida, retire apenas quando is dentro da cabine de segurança biológica. </li><li> Para uma cultura de 30 ml, retirar 26 ml de meio A e 3 ml de Meio B (10% da cultura final) e transferir para o frasco de cultura de Erlenmeyer de 125 ml e misturar suavemente por agitação (daqui em diante denominado como meio de cultura fresco). </li><li> Transferência de um frasco de células contendo células HEK293F, congeladas a -80 ° C, em gelo e mover-se para a sala de cultura. Nota: as células HEK293F são fornecidos a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml. </li><li> Aquecer suavemente o frasco em banho-maria a 37 ° C para descongelar as células parcialmente (isto leva aproximadamente um minuto e células não deve ser completamente descongelado). Esteriliza-se o exterior de um frasco com o etanol a 70% em solução de água e movê-lo para a cabine de segurança biológica. </li><li> Usando uma pipeta de 1 ml, retirar a suspensão de células (aproximadamente 0,7 ml) e transferir para o balão de Erlenmeyer de 125 ml contendo 29 ml de meio de cultura fresco. Fechar a tampa do frasco de cultura e movê-lo para o agitador incubadas. </li></ol&gt; </li><li> Manutenção celular: Verifique densidade celular, viabilidade e Passages Celulares <ol><li> Verifique a densidade de células após 24 h de descongelação da cultura seguindo o protocolo abaixo. Nota: As células são cultivadas durante 24 horas após a descongelação para garantir células essenciais de crescimento e viabilidade&gt; 80%. </li><li> Esteriliza-se o frasco de cultura com o etanol a 70% em solução de água e movê-lo para a cabine de segurança biológica. </li><li> Usando uma pipeta de 1 ml e pipeta, retirar lentamente 100 ul de suspensão de cultura e transferência para um filtro estéril de 0,5 mL Eppendorf tubo. Fechar e transferir o frasco de cultura de volta para o agitador o mais rapidamente possível. </li><li> Misture 7,5 ul de uma solução de azul de tripano, com 7,5 ul de células. Misture vigorosamente com 7,5 ul da célula / Trypan mistura azul e transferi-lo para o slide contagem. </li><li> Ligue o contador de células automático e contagem coloque a lâmina para dentro da câmara de carregamento. O leitor automático é activado e células são contados automaticamente nas unidadesdo número de células por ml e viabilidade por cento </li><li> Determinar o volume da cultura requerido para o dador de transferência para um meio de cultura fresco a uma densidade de células de 0,3 x 10 6 células / ml vivo. Nota: Veja um exemplo de cálculo em Materiais adicionais. </li><li> Repita os passos 1.1.2 e 1.1.3 do protocolo &quot;1,1 Cultura Inoculação&quot; acima para preparar os materiais necessários para o meio de cultura fresco. </li><li> Transferir Meio A (23 ml) e Meio B (3 ml) a um balão de 125 ml de cultura fresco. Retirar as garrafas de ações de médio A e B Médio do gabinete de biossegurança. Nota: Os stocks de garrafas de material não deve ser mantida no armário de segurança biológica, ao mesmo tempo que as células HEK 293F. Isto limita a possibilidade de contaminação das garrafas médias estoque. </li><li> Remover a cultura de células HEK293 da incubadora e pulverizar com o etanol a 70% em solução de água. Usando uma pipeta nova, retirar a alíquota de células (4 ml, este volume foi determinado de acordo com tO passo 1.2.6) a partir da cultura e transferi-lo para o balão que continha meio de cultura fresco. </li><li> Transferir as duas culturas a partir do gabinete de biossegurança para o shaker incubadora definido de acordo com 1.1.1. Crescer as células até uma densidade de aproximadamente 2-3 x 10 6 células / ml vivo. Nota: O tempo de duplicação das células é de aproximadamente 32 h. Vai demorar 3-4 dias para chegar a esta densidade. Incubam-se as células durante 3-4 passagens para ter o padrão de crescimento de células estável antes da primeira transfecção. </li></ol></li></ol> 2. Prepare Materiais para Transfection <ol><li> Preparando células HEK293 (Dia 1) <ol><li> Subcultura de células a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em meio fresco B 24 h antes da transfecção de acordo com o Passo 1.2. Nota: O volume da cultura de transfecção será dependente do número de células. Maiores volumes de transfecção (&gt; 20 ml) vai exigir um maior volume de cultura nesta fase. </li></ol></li><li> Preparando Stocks de Materiais <ol><li> Preparar a solução de estoque de polietilenimina linear (PEI) a uma concentração de 1 mg / ml num tampão contendo 25 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico ácido (HEPES) e NaCl 150 mM (pH 7,5). Dissolver completamente PEI; isto pode demorar 30-60 min à temperatura ambiente. Esterilizar através de filtro de seringa de 0,22? M e armazenamento a -20 ° C para uso a longo prazo. </li><li> Preparar DNA de plasmídeo estéril (de acordo com os passos 2.2.2.1-2.2.2.4). O processo de construção do plasmídeo está descrita em outro lugar 42. Uma breve procedimento para a preparação de DNA é explicado aqui: <ol><li> Crescer uma cultura de células de Escherichia coli quimicamente competentes-transformadas com o vector pGEn2 em 1 L de meio LB (Tryptone- 10 g / L, levedura Extrato de 5 g / L e chloride- de sódio a 10 g / l) suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. E. coli é cultivada a 37 ° C em um não-humidificado, incubador com agitação. </li><li> Purifica-se o ADN que codifica pGEn2 plasmídeo vector alvo de acordo com a manuprotocolo de purificação de DNA cante. </li><li> Para garantir a esterilidade completa do DNA plasmídeo, execute as isopropanol precipitação e ressuspensão etapas finais dos procedimentos de extração de DNA dentro da cabine de segurança biológica. </li><li> Adicionar o volume de isopropanol (especificado no kit de preparação de plasmídeo) para o DNA eluído e centrifugar a 10.000 x g durante 10 min. Esteriliza-se o exterior do recipiente de ADN com etanol a 70% em solução de água e transferi-lo no interior do armário de biosegurança. Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta de isopropanol e ar-secar o sedimento de DNA. Depois de seco, ressuspender o sedimento em tampão Tris 10 mM estéril, pH 8,0. </li></ol></li><li> Preparar a solução de estoque de 220 mM de ácido valpróico (VPA) em água e esterilizar por passagem através de um filtro estéril de 0,22 um. Guardar a solução a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li></ol> 3. Estabelecer uma transfecção transiente <ol><li> A transfecção (dia 0) <ol><li> Verifique a densidade de células seguindo os passos 1.2.2 através de 1.2.5 de &quot;1.2. Manutenção celular&quot; acima. Determinar a quantidade de células para a transfecção (2,5-3,0 x 10 6 células / ml em directo com a viabilidade&gt; 95%). Veja um exemplo de cálculo em Materiais adicionais. </li><li> Transferir o volume de células de cultura em suspensão calculados na etapa anterior (aqui 67 ml) para um tubo de centrífuga de 250 ml usando uma pipeta serológica estéril. Recolher as células por centrifugação durante 5 min a 100 x g. </li><li> Enquanto isso, prepare-se um meio de cultura fresco transfecção seguinte passo 1.1.3 de acordo com &quot;1.1. Inoculação Cultura&quot; acima. Veja os Materiais suplementares para o cálculo da amostra. Além disso, a transferência de 5 ml de meio de cultura fresco para um tubo estéril de 15 ml e retiradas. </li><li> Tubos de transferência contendo as células sedimentadas na cabine de segurança biológica depois de esterilizar o exterior dos tubos com o etanol a 70% em água e solução de usar uma pipeta estéril para decantar the sobrenadante que consiste em meio de cultura gasto. </li><li> Vigorosamente ressuspender as células sedimentadas por pipetagem para cima e para baixo usando 10 ml de meio de cultura fresco e transferir para o frasco com meio de cultura fresco a transfecção (preparado no passo 3.1.3, supra). Colocar a tampa na garrafa de cultura de células ventilado e mover o balão para a incubadora (como definido em 1.1.1) para 15 min-1 h com agitação. </li><li> Durante este tempo, dilui-se o ADN plasmídico e os estoques de PEI, utilizando meio de cultura fresco (utilizando o volume de 5 ml a partir do passo 3.1.3 retirada acima) a uma concentração final de 0,5 ug / ul. Veja exemplos de cálculos em Materiais adicionais para determinar a quantidade de DNA e PEI. Transferir o frasco de cultura com as células dispersas na cabine de segurança biológica. </li><li> Adicionar DNA de plasmídeo (300 ul de 0,5 mg / mL) para a cultura utilizando micro-pipeta e misturar por agitação manual suave. Adicionar PEI (900 ul de 0,5 mg / mL) para a cultura, misturar agitando suavemente. Adicionar 3,8 ml de cul frescomédio ture, a partir do passo 3.1.3, acima e frasco de transferência para o shaker incubadora durante 24 h. </li><li> Limpe o gabinete de biossegurança de acordo com o Passo 1.1. </li></ol></li><li> Diluição (Dia 1) (Para um volume de 50 ml de transfecção) <ol><li> Incubar a cultura transfectadas durante 24 horas. </li><li> Retirar 1 mL de ácido valpróico pré-aquecido de 220 mM (VPA; preparado de acordo com o passo 2.2.3.), Utilizando uma pipeta de 1 mL estéreis serológica e transferi-lo para um tubo estéril de 50 ml. </li><li> Retirar 5,0 ml de Meio B pré-aquecido e pré-aquecida de 44 ml de meio A e este adicionar à solução VPA usando uma pipeta serológica estéril para preparar 50 ml de meio de cultura fresco com uma concentração final de 4,4 mM de VPA. </li><li> Mover a cultura transfectado para a cabine de segurança biológica depois de esterilizar o exterior da garrafa com um 70% de etanol em solução aquosa, adicionar o meio de diluição preparada e transferir do frasco de volta para o agitador incubadas. </li></ol></li><li> Expressão e colheita (Dias 2-6) <ol><li> Incube as celulas por mais 4-5 dias (5-6 dias no total desde a transfecção). </li><li> Retirar alíquotas de meio de cultura seguintes passo 1.2.2. a 1.2.5. descrito em &quot;1.2. Manutenção celular&quot;, acima, utilizando uma pipeta de 1 ml estéril sorológica, para monitorar a viabilidade de células e salvar alíquotas para analisar a expressão da proteína em cada dia por SDS-PAGE (veja Seção 5, abaixo). </li><li> Células de 5-6 dias após a colheita por centrifugação do meio de células mais a 1000 g durante 5 min. Além disso, a colheita do sobrenadante se a viabilidade celular cai abaixo de 50% (ver passos 1.2.2-1.2.5). </li><li> Decantar o sobrenadante que contém proteína segregada. Adicionam-se 5 ml de uma lixívia a 10% ao sedimento celular HEK e descartar como um perigo biológico. </li></ol></li></ol> 4. Purificação de Proteínas <ol><li> Prepara-se uma coluna com 5 ml de Proteína-A Sepharose. Equilibrar a coluna com 5 volumes de tampão A (20 mM de 3- (coluna N-morfolino) propanossulf único (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCeu). </li><li> Centrifuga-se o sobrenadante recolhido com proteína expressa a alta velocidade (14.000 g durante 10 min) para remover todos os restos de células remanescente. Recolhe por decantação para um tubo fresco. Desprezar o pelete como um perigo biológico. </li><li> Recolhe-se uma alíquota de 10 ul do sobrenadante e, adicionalmente, recolher uma pequena amostra em cada etapa de purificação da proteína para analisar a amostra por SDS-PAGE (descrito na Secção 5). Carregar o sobrenadante clarificado e recolher o fluxo através. </li><li> Lava-se a coluna com volumes de tampão A 3-coluna e elui-se a proteína com volumes de 100 mM de glicina, pH 3,0, 5-coluna. Recolhe-se o eluato em tubos contendo metade do volume de tampão Tris 1 M, pH de 8,0 para neutralizar rapidamente o pH. </li><li> Lava-se a coluna com 10 volumes de coluna de tampão A e armazenado para utilização futura. </li><li> Tampão de trocar a proteína eluída com pelo menos um excesso de 10 vezes de tampão A por meio de 10 kDa de peso molecular filtros centrífugos de corte. Nota: Não se concentrar a amostra eluída aum volume muito baixo (&lt;2 ml) no tampão eluiu. Use os filtros centrífugas para trocar o tampão com tampão A. </li><li> Loja proteína purificada a 4 ° C até à próxima utilização. Nota: A proteína expressa no sobrenadante pode ser purificado por colunas de afinidade, seleccionados com base nas propriedades da proteína ou a utilização de marcas de afinidade. Por um procedimento de purificação típico, Proteína A coluna pode ser utilizada para IgG ou fragmentos Fc ou coluna de níquel pode ser utilizado para proteínas expressas com um marcador de poli-histidina. Aqui, é uma descrição dos passos de purificação para a IgG1-Fc utilizando uma coluna de proteína. </li></ol> 5. Análise de proteína por SDS-PAGE <ol><li> Dilui-se alíquotas (7,5 ul) de cada amostra com um volume igual de 2X tampão de carga (Tris 0,125 M, pH 8,0, SDS a 4%, 10% β-mercaptoetanol, 20% de glicerol e 0,01% de azul de bromofenol). </li><li> Ferve-se a mistura a 90 ° C durante 5 min, utilizando um bloco de aquecimento ou banho-maria. Centrifugar as amostras a 10.000 g foR 1 min. Carregar o gel preparado com 5 ul de proteína marcadora e 14 ul de amostras para análises utilizando uma pipeta de 20 mL com uma ponta descartável. </li><li> Execute um gel a 25 miliamperes para 60 min. Uma vez que o passo de electroforese é completa, transferir o gel para um recipiente com 1 L de água e de microondas durante 5 min. </li><li> Corar o gel com solução de coloração (etanol a 40%, ácido acético a 10% e 0,1% de azul brilhante de Coomassie) durante 2 horas e destain em água. </li></ol> 6. Glicanos Análise por Espectrometria de Massa <ol><li> Analise glicanos, tal como descrito anteriormente 44. Resumidamente, 75 ug de IgG1-Fc foi tripsinizadas, em seguida, tratada por PNGaseF para a libertação de 45 glicanos. Glicanos libertados foram analisados ​​e permetilado usando ionização de dessorção laser espectrometria de massa assistida por matriz-tempo de voo (MALDI-TOFMS). </li></ol> 7. Ajustes de protocolo para Cenários especiais <ol><li> Marcar proteínas com 15 N-Aminoácidos marcado (para um volume de 50 ml de transfecção) <ol><li> Dispensar 5 mg de cada um dos aminoácidos em um único frasco de vidro estéril. Ressuspender com 4 ml de água autoclavada (nota Tyr não completamente solubilizar, ao contrário de Lys e Phe). Esterilizar a solução em autoclave a 121 ° C durante 15 min. Deixar a solução arrefecer para cerca de 50-60 ° C. </li><li> Para um volume de transfecção de 50 ml, siga o passo 3.1.3 de acordo com &quot;3.1 O estabelecimento de uma transfecção transitória&quot;. Consulte a seção Materiais adicionais para um exemplo com volumes adequados. </li><li> Para a transfecção, seguir os passos de &quot;3. Estabelecimento de uma transfecção transiente&quot; com meio de cultura fresco substituído com resíduos de aminoácidos marcados como preparado acima. </li><li> Após 24 horas da transfecção, no dia da diluição da cultura, retirar 5,0 ml de Meio B pré-aquecida, pré-aquecida de 40 ml de Meio A esterilizado e um recém-4 mL alíquota da mistura de amino ácido (preparado como no passo 7.1.1. Supra) e adicionar 1pré-aquecido ml de solução de solução mãe de VPA para preparar 50 ml de meio de cultura fresco a diluição com uma concentração final de 4,4 mM de VPA. Adicionar este meio para a cultura de transfecção usando uma pipeta serológica estéril. </li><li> Transferir a cultura transfectado para a cabine de segurança biológica depois de esterilizar o exterior da garrafa com um 70% de etanol em solução aquosa, adicionar o meio de diluição preparada e transferir o frasco de volta para o agitador incubadas. Nota: Meio A é, um meio isento de soro quimicamente definido. Assim, é possível preparar uma formulação diferente. Entre em contato com o fornecedor para obter um costume Médio Uma preparação que carece de certos aminoácidos. É possível ter todos os aminoácidos deixado de fora, no entanto, é preferível utilizar meio que carece apenas alguns resíduos de escolha porque um meio de abandono completa exigiria o ajustamento da osmolaridade após a suplementação. Nós escolhemos um meio de abandono Lys-Tyr-Phe que pode ser completada e não necessita de ajustamento da osmolaridade. Furthermore, o meio Um fornecedor não partilha livremente as concentrações dos componentes do meio; utilizou-se 100 mg / L de cada uma para Lys, Tyr e Phe com sucesso. Os volumes do meio de transfecção e expressão deve ser ajustado para ter em conta os aminoácidos adicionados. Aqui estão as adaptações do protocolo acima para a rotulagem isótopo </li></ol></li><li> Suplemento a transfecção com uma pequena molécula <ol><li> Preparar a solução de estoque de 100 mM de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucose usando água autoclavada e esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 um. </li><li> Para uma cultura de 50 ml, adicionar 125 ul (a 250 uM) da solução de fucose analógico para o meio de transfecção e de diluição. Nota: Foram negligenciada para efectuar qualquer ajuste adicional de volume porque a adição do substituinte, pelo que esta representa concentração de apenas 0,25% do total .É volume de cultura é possível modificar a expressão utilizando pequenas moléculas inibidoras de processamento de glicano. Aqui nós descrevemos as condições para a inclusão de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucose, um inibidor da fucosilação glicano. Encontrámos&gt; 90% de redução em fucosilação adicionando o análogo de fucose na concentração de 250 uM em meio de transfecção e a diluição. </li></ol></li></ol>

All authors declare no competing financial interests in this manuscript.

Este protocolo ilustra a expressão de proteína através da transfecção transitória de células HEK293F ou S. As condições de transfecção ideais estabelecidos nos laboratórios Barb e Moremen empregam uma combinação crítica de concentrações densidade celular e reagentes para atingir alta eficiência de transfecção. Considerações críticas na aplicação da presente protocolo incluem: manutenção de uma cultura estável antes da transfecção (com a cultura consistente vezes duplicação); transfecção...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

A produção de rendimentos elevados de proteínas humanas adequadamente dobrados e modificada pós-translacionalmente por análise detalhada da estrutura e função continua a ser um desafio significativo. Um grande número de sistemas de expressão disponíveis que produzem proteínas recombinantes com função e comportamento semelhante à nativa. Sistemas de expressão bacterianos, predominantemente estirpes de Escherichia coli, representam as ferramentas mais acessíveis e frequentemente utilizadas na área da pesquisa, devido à simplicidade destes sistemas de expressão, embora sistemas de mamíferos levedura, plantas, insectos e são também descritos 1-4. No entanto, a maioria destes sistemas são incapazes de modificação pós-tradução adequada das proteínas alvo. Um interesse fundamental dos laboratórios Barb e Moremen está produzindo proteínas eucarióticas com glicosilação apropriada. Muitas proteínas humanas exigem glicosilação adequada para o bom funcionamento (ver 5). O eucarióticamaquinaria de glicosilação é extensa e capaz de fazer uma grande variedade de modificações, incluindo tanto a asparagina (N) - e serina / treonina (O) -linked glicanos complexos 6. Estima-se que&gt; 50% das proteínas humanas são N-glicosilados 7. Glicanos são componentes essenciais de muitas proteínas incluindo anticorpos monoclonais terapêuticos, eritropoietina e fatores de coagulação do sangue, como factor IX, para citar alguns. Apesar de existirem vários métodos para preparar adequadamente proteínas N-glicosiladas e variam de puramente sintético 8-10, para 11-14 quimioenzimáticas ou recuperação de sistemas recombinantes engenharia 15-20, não surpreendentemente, sistemas de expressão humanos têm, até agora provou ser o mais robusto métodos para gerar proteínas humanas. Muitos glicoproteínas terapêuticas humanos são produzidos em sistemas recombinantes que utilizam células de mamífero. Sistemas de nota são o de ovário de hamster chinês (CHO), mieloma de ratinho (NS0), Baby Hamster kidney (BHK), rim embrionário humano (HEK-293) e linhas de células da retina humanas que são empregues na adesão ou suspensão de cultura para a produção de proteína 4,21,22. No entanto, os sistemas de expressão de proteína de mamífero têm exigido a geração de linhas celulares estáveis, meios de cultura caros e procedimentos de transfecção de substrato assistida 23. Transfecção de células de mamífero é conseguido com o auxílio de numerosos agentes, incluindo fosfatos de cálcio 24,25, polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polibreno, polilisina, polietilimina (PEI)) ou lipossomas catiónicos carregados positivamente 26-29. PEI é um policatiónico, carregada, linear ou ramificada de polímero (25 kDa) 26 que forma um complexo estável com o ADN e é sujeita a endocitose. Após acidificação do endossoma, PEI é pensado para inchar, levando à ruptura dos endossomas e libertação do ADN para o citoplasma 26,30. Até recentemente, a transfecção transiente em suspensia cultura foi realizada por formação de complexos de ADN / PEI antes, seguido pela adição à cultura de células 29. No entanto, Würm e colaboradores relataram um protocolo optimizado altamente eficiente para a produção de proteína recombinante em células HEK293 que formaram um complexo de ADN / PEI in situ 31,32. Isto evitou a preparação, a esterilização do complexo, e a troca de tampão para um meio de cultura. Otimização, incluindo plasmídeos de aumento de expressão levaram a aumentos significativos de produtividade 33. Aqui é um método que se baseia esses avanços e é amplamente aplicável. Condições de expressão, também pode ser alterado para afectar a composição de N-glicanos. A linha celular HEK293S, com uma deleção do gene que interrompe o processamento de N-glicano numa fase intermédia, leva-se à expressão de proteínas com uniformes N-glicanos que consistem de 2 resíduos de N-acetilglucosamina e mais cinco resíduos de manose (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Estas célulasfalta a transferase de N-acetilglucosaminil I (GnTI) gene que é necessário para o processamento de N-glicanos a jusante 36,37. A utilização de inibidores de glicosiltransferase incluindo kifunensine, análogos de ácido siálico e fucose e o análogo de 2-desoxi-2-fluoro-fucose e possui efeitos de processamento de N-glicanos 38-41 limites semelhantes. O protocolo aqui relatada utiliza o vector pGEn2 como mostrado na Figura 1 42,43, PEI assistida transfecção transiente em células de mamífero (linhas HEK293F HEK293S ou células), e a recuperação de rendimentos elevados de proteína apropriadamente glicosilada. Este sistema é robusto e pode acomodar vários factores, incluindo a marcação isotópica e engenharia de glicano para a produção de grandes títulos de proteínas recombinantes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>CellGard ES NU-S475-400</td>
			<td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Multitron Cell&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>14571C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeStyle HEK 293F Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>161263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>23966</td>
			<td>Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 &#956;M syringe filter and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Syringe Filter, 0.22 &#956;M</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisaminomethane (Tris base)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>222249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Analytical&#160;</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH chemicals</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic (VPA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4543</td>
			<td>Prepare stock solution of 220 mM&#160; in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#63720; 250 mL Centrifuge Tube&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EW-17707-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-Sepharose column</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa molecular weight cut-off Amicon&#174; Ultra centrifugal filters&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial&#160;</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie brilliant blue&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Tyrosine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>332151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Lysine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>592900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled L-Phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&#160;</td>
			<td>SANTA CRUZ Biotechnology</td>
			<td>sc-283123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension

A arte da produção de proteínas recombinantes com modificações pós-tradução complexas representa um grande desafio para estudos da estrutura e função. O estabelecimento rápido e elevada recuperação de linhas celulares de mamífero transf ectadas transitoriamente aborda esta barreira e é um meio eficaz para expressar as proteínas que são naturalmente canalizados através da via secretora do ER e Golgi-mediada. Aqui é um protocolo para a expressão da proteína usando a HEK293F humano e linhas de células HEK293S transfectadas com um vector de expressão de mamífero concebido para rendimentos elevados de proteína. A aplicabilidade desse sistema é demonstrada por meio de três glicoproteínas representativos que expressavam com rendimentos entre 95-120 mg de proteína purificada recuperada por litro de cultura. Estas proteínas são a FcγRIIIa humana e a sialiltransferase de rato α2-6, ST6GalI, ambos expressos com uma fusão com GFP N-terminal, bem como a imunoglobulina humana G1 Fc não modificada. Este robusto sistema utizará um meio isento de soro que é adaptável para a expressão de proteínas e hidratos de carbono para estudos estruturais, utilizando espectrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear isotopicamente enriquecidos. Além disso, a composição do N-glicano pode ser ajustado por adição de uma pequena molécula para evitar certas modificações de glicano de uma maneira que não reduz o rendimento.

A expressão da proteína de alto nível e pureza Este sistema de expressão optimizada gerado um elevado rendimento de proteínas glicosiladas. Um modelo típico é mostrado na expressão da IgG1-Fc (Figura 1). Neste caso, é o dia 0 o dia da transfecção seguido por Dia 1 (diluição) e dias de cultura subsequentes, até ao dia 5. A expressão da proteína é analisada utilizando a fracção de expressão s...

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High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

high-yield-expression-recombinant-human-proteins-with-transient

Research

JoVE Journal

Biology

29.5K visualizações.  Iowa State University. Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Vídeo: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Medição Rendimento Absoluto Quantum of amostras de pó

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...