Quantificação de espécies reativas de oxigênio usando 2′,7′-Sonda diacetato de diclorofluoresceína e flução-citometria em células gliais Müller

Existem vários métodos para medir a produção de ROS, ou estresse oxidativo nas células. Entre estes, a sonda diacetato de 2'7'dichlororescein é uma das técnicas mais utilizadas para medir diretamente o estado de redox. Esta sonda é lipofílica e não fluorescente. A difusão desta sonda através da membrana celular permite que o decote de esteras intracelular nas duas ligações éster, produzindo um produto relativamente polar e imune à membrana celular. Essas moléculas não fluorescentes acumulam-se intracelularmente, e a oxidação subsequente pela ROS produz o produto altamente fluorescente diclorofluoresceína. A oxidação da sonda é o produto da ação de múltiplos tipos de ROS. Que pode ser detectado por citometria de fluxo ou microscopia confocal. Neste artigo, usamos uma sonda diacetato de diclorofluoresceína para medir e quantificar ros por citometria de fluxo. Transfira placas de 6 poços para um capô de fluxo laminar da incubadora. Aspire o supernatante. E lave as células uma vez com PBS. Adicione 2 mL de DMEM de baixo soro por poço. E incubar a placa de 6 poços por duas horas na incubadora. Trate as células com o antioxidante por seis horas. Trate as células com o indutor ROS, A ou B, por 30 minutos. Aspire o supernatante. E lave a célula três vezes com PBS para remover todos os estímulos. Desligue a luz do capô de fluxo laminar e trabalhe na escuridão. Adicione 1 mL de sonda diacetato de diclorofluoresceína em DMEM sem vermelho fenol. Adicione 1 mL de DMEM sem fenol vermelho às células de controle de autofluorescência de controle. Incubar a placa de 6 poços por 30 minutos na incubadora. Transfira as placas no gelo para o laboratório. Lave as células três vezes com 2 mL de PBS frio por poço. Adicione 0,5 mL de tampão de desprendimento a frio a cada poço. Colher as células gentilmente tubos para cima e para baixo usando uma pipeta P1000. Colete-os no tubo de 1,5 mL rotulado. E centrifuá-los a 600 x g por cinco minutos a 4 C.Descarte o supernatante cuidadosamente, e dissocia suavemente a pelota com toques. Adicione 1 mL de tampão FACS para lavar as células em cada tubo rotulado. Se for necessário, use vórtice na menor intensidade para a dissociação completa da pelota. Centrifuá-los a 600 x g por cinco minutos a 4 C.Repita esta etapa duas vezes mais. Três lavagens no total. Pelotas de células resuspend em 200 L de buffer FACS. Dissociar suavemente completamente a pelota em cada tubo usando vórtice. E transfira para 5 mL rotulados para tubos de citómetro de fluxo. Mantenha os tubos no gelo até analisar o citômetro de fluxo. Usando o software de citometria de fluxo, crie um novo experimento. Clique no espécime e abrirá uma lista de tubos. Clique duas vezes e renomeie-os. Coloque o tubo de controle de autofluorescência no braço aspirador, movendo a base cuidadosamente apenas para a esquerda. Clique em Adquirir dados e, em seguida, registo dados e selecione a condição de parada desejada. Desenhe um portão ao redor das células de interesse, excluindo células mortas e detritos. Remova o tubo. Clique no Next Tube e execute a amostra de controle basal. Clique em Adquirir Dados e, em seguida, em Gravar Dados.Abra o software. Adicione as amostras usando o botão Adicionar amostras de ação. Clique em Adicionar amostra.Selecione a pasta Data Experimental e clique em Escolher.Clique duas vezes na primeira amostra em seu espaço de trabalho, controle de autofluorescência neste caso. Desenhe um portão de polígono para isolar a célula de interesse, excluindo células mortas e detritos. Mude o enredo para um histograma. Clique duas vezes dentro do M