Obrigado a Yanyang Bai por ajudar com o immunoblot na Figura 5. Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 to AC]; Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 para AC]; Scottish Rite Charitable Foundation [21103 para AC] e a Brain Canada Foundation [AWD-023132 para AC]; University of British Columbia Aboriginal Graduate Fellowship (6481 para MT); British Columbia Graduate Scholarship (6768 para MT); Prêmio Acadêmico Estudantil da Plataforma Aberta de Neurociência Canadense (10901 para JK); Bolsa de Doutorado de quatro anos da Universidade da Colúmbia Britânica (6569 para JK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

Quantificação de modificação de histonas cerebrais de camundongos usando citometria de fluxo

<ol>
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Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado permite a avaliação quantitativa dos níveis globais de HPTM por citometria de fluxo. Embora este protocolo apresente um novo método, estudos anteriores fizeram avaliação quantitativa de proteínas usando uma abordagem semelhante26. Métodos prévios utilizados para avaliar os níveis globais de HPTMs incluem imunohistoquímica e western blot 16,17,19,20. O método baseado em citometria de fluxo apresentado é um método facilmente quantificável, enquanto o western blot e a imunohistoquímica são semiquantitativos e apresentam menor rendimento. O Western blot depende da lise celular e, portanto, requer tanto a normalização da proteína quanto uma proteína de controle de carga que é assumida como inalterada pela condição experimental27. A imuno-histoquímica é semiquantitativa e de baixíssimo rendimento, pois é difícil avaliar quantitativamente a quantidade de proteína sem examinar em nível de célula única16. Da mesma forma, para a micróglia isolada, há um benefício no uso do método de citometria de fluxo devido ao rendimento limitado, uma vez que o western blot requer uma entrada proteica muito maior19. Os requisitos de baixo número de células permitem que vários painéis de coloração sejam executados a partir do mesmo animal.
No entanto, como em qualquer outro método, há limitações para essa técnica, incluindo custo e disponibilidade de anticorpos, já que nem todos os anticorpos funcionam bem em um cenário de citometria de fluxo. Além disso, em comparação com o immunoblot, a concentração de anticorpos necessária é muito maior. Enquanto a multiplexação permite que vários anticorpos sejam usados no mesmo painel de células, as células não podem ser destituídas do anticorpo após a análise, limitando assim o uso celular a um por espécie de anticorpo. Isso é diferente do immunoblot, em que o mesmo blot pode ser usado repetidamente. No entanto, dependendo da disponibilidade de anticorpos e do número de canais de detecção em um citômetro, seria possível examinar até uma dúzia de marcas simultaneamente.
O método atual captura apenas os níveis globais de expressão proteica e não a localização genômica específica, e mudanças nos níveis globais podem não refletir mudanças nos loci genômicos individuais. Da mesma forma, a falta de mudança nos níveis globais pode não significar que nenhum loci genômico está passando por mudanças, simplesmente que as mudanças globais não somam diferenças entre os tratamentos. Como tal, esta técnica destina-se a ser usada como uma tela para identificar HPTMs de interesse para análise genômica. Além disso, este método não permite a comparação entre diferentes marcas de proteínas, exceto quando avaliado como uma mudança de dobra para controle. Portanto, isso é limitado em comparação com um método padrão baseado em curvas, como o ELISA, para determinação de proteínas.
O protocolo apresentado oferece uma estratégia para isolar a micróglia cerebral viva. Este protocolo baseia-se na expressão da proteína P2RY12 para o isolamento da micróglia. No entanto, o P2RY12 é um marcador homeostático na micróglia e pode ser regulado negativamente em modelos de doenças, como o 5XFAD22. Portanto, ao utilizar um animal modelo de doença, certifique-se de escolher outras proteínas marcadoras, como TMEM119, CD11b ou CD45, para auxiliar no isolamento da micróglia23. Da mesma forma, apresentamos este protocolo como isolamento do hipocampo e/ou córtex. Este protocolo funcionaria para isolar a micróglia de outras regiões do cérebro, incluindo regiões da substância branca, no entanto, vários animais podem ser necessários para obter microglia suficiente, dependendo do tamanho das regiões de interesse.
O protocolo apresentado pode isolar de forma robusta a microglia cerebral viva, mas existem várias etapas, descritas a seguir, na fase de isolamento que podem diminuir o rendimento celular se realizadas de forma incorreta.
As perfusões para este protocolo resultam em uma maior porcentagem de micróglia no fragmento enriquecido imune, o que reduzirá a quantidade de tempo no classificador. No entanto, a perfusão não é necessária, e outros métodos de eutanásia podem ser usados, se necessário.
Durante o isolamento da micróglia, a mielina deve ser completamente removida. Os citômetros de fluxo dependem que as células sejam capazes de viajar através de tubos estreitos em um ritmo rápido. Devido à sua viscosidade e tendência à aglomeração, a mielina causa problemas com citômetros, muitas vezes causando entupimentos que podem danificar o equipamento e destruir a amostra, reduzindo drasticamente o rendimento. Tenha cuidado para remover toda a mielina durante a coleta de fragmentos enriquecidos imunologicamente para evitar ter problemas a jusante.
Coloração de placa versus coloração de tubo: Neste protocolo, descrevemos duas opções para coloração de células em tubos de 1,5 mL ou em uma placa de 96 poços. O caso de uso para cada um depende do experimento; no entanto, geralmente a coloração do tubo é menor risco de afetar o rendimento do que a coloração da placa, pois o flick corre o risco de perda de células se feito incorretamente. A coloração da placa é muito mais rápida, pois a aspiração do sobrenadante para cada tubo é demorada. Antes da fixação (para triagem, etc.), use coloração de tubo para maximizar o rendimento e reduzir o risco de perda. No entanto, para a análise por HPTM, uma vez que as células são fixadas para coloração intranuclear, o pellet é mais estável, e há risco reduzido de perda com a cintilação.
Estabelecer o gradiente de densidade descontínuo: Ao estabelecer as camadas, a configuração adequada das camadas é essencial para obter a fração imunoenriquecida. Se as camadas forem perturbadas ou misturadas e parecerem turvas, as células não se classificarão para o local desejado e haverá dificuldade em obter a fração celular imunoenriquecida. Se isso ocorrer, gire com o meio de densidade para remover a mielina e, em seguida, colete todas as frações restantes, dilua com 3 mL de tampão FACS para 1 mL de meio de densidade e misture bem (isso exigirá vários tubos). Gire a 500 x g por 10 min com o freio ligado em 0. Descarte o sobrenadante, deixando apenas ~300 μL de solução. Coletar toda a amostra e manchar. Isso resultará em porcentagens de classificação reduzidas e uma quantidade maior de tempo gasto no citômetro, mas o rendimento ainda pode ser comparável.
Ao usar o método de isolamento, é benéfico ser capaz de coletar células para RNA e para avaliação de HPTM do mesmo cérebro de camundongo. Nessa situação, após a classificação da micróglia viva, as células podem ser divididas para alocar uma porção para avaliação de RNA (número mínimo de entrada de células para obter um rendimento de RNA decente é de 75.000 células) e uma porção para análise de citometria de fluxo adicional (mínimo de 10.000 células por poço para boa determinação de MFI). Nesse caso, a triagem por citômetro de fluxo é necessária. No entanto, ao planejar apenas o uso das células para análise de HPTM, a classificação não é necessária, e a fração imune pode ser corada com o anticorpo P2RY12 e o anticorpo HPTM. O acoplamento no citômetro pode então ser ajustado para a microglia P2RY12+, como seria feito para a classificação de fluxo, para analisar apenas o sinal de HPTM dentro da micróglia. A eliminação da classificação permite que o protocolo seja mais rápido e econômico. Além disso, se avaliarmos HPTMs a partir de células cultivadas, iniciar o protocolo de coloração é suficiente e nenhum tipo de anticorpos marcadores celulares é necessário, como demonstrado na Figura 6. O protocolo de avaliação HPTM pode ser usado para muitos tipos celulares, incluindo células cultivadas, primárias e derivadas de IPSC.
Finalmente, embora tenhamos apresentado apenas dois usos potenciais da microglia a jusante do isolamento, existem muitos outros, incluindo técnicas epigenéticas como ChIP, CUT&Tag e CUT&RUN. No caso de técnicas epigenéticas genômicas, em que caracterizar alterações em loci específicos é de interesse, escolha inibidores específicos para escritores e borrachas de marcas de cromatina11 adaptados aos experimentos para garantir que quaisquer modificações epigenéticas microgliais perfiladas não sejam artefatos técnicos de quaisquer etapas do procedimento de isolamento, como a digestão enzimática. Ao avaliar mudanças nos níveis globais de marcas epigenéticas, como por citometria de fluxo quantitativa, não se espera que quaisquer alterações induzidas pelo procedimento sejam tão grandes a ponto de serem detectadas em nível global.
Em geral, os métodos discutidos fornecem um novo método de célula única para quantificar os níveis globais de modificações de histonas e outras alterações epigenéticas por citometria de fluxo. Nós demonstramos que este método é suficientemente sensível para detectar mudanças globais no marcador intensificador H3K27ac em micróglia em resposta ao LPS in vivo. Isso é consistente com o sequenciamento prévio de ChIP de H3K27ac após estimulação com LPS mostrando remodelamento dramático de intensificadores responsivos ao LPS28. As aplicações deste método permitirão examinar as alterações epigenéticas globais em diferentes tipos de células cerebrais em desenvolvimento e doença.

Epigenética é o estudo dos mecanismos que regulam a expressão gênica sem alterar a sequência de DNA subjacente. A regulação epigenética da expressão gênica é dinâmica dentro das células e pode permitir respostas rápidas e coordenadas a vários estímulos ambientais. A regulação dinâmica ocorre em parte devido a mudanças na estrutura da cromatina ao nível do nucleossomo, que é composto por proteínas de histonas (H2A, H2B, H3, H4) reunidas em um núcleo octamérico firmemente enrolado pelo DNA1. As interações entre as proteínas das histonas e o DNA podem controlar a acessibilidade do DNA à maquinaria de transcrição, que pode, em última análise, controlar a expressão gênica e outros aspectos da biologia da cromatina2. As proteínas Histone têm caudas não estruturadas que apresentam resíduos carregados positivamente que formam interações eletrostáticas com a espinha dorsal de DNA carregada negativamente. Essas interações resultam em empacotamento apertado do DNA e acessibilidade reduzida ao DNA. Modificações covalentes nas caudas das histonas, denominadas modificações pós-traducionais de histonas (HPTMs), podem regular essas interações 3,4. Algumas das HPTMs mais bem caracterizadas incluem acetilação e metilação da cauda de histonas, que podem alterar a afinidade das interações eletrostáticas entre as caudas de histonas e o DNA, resultando em acessibilidade diferencial ao DNA subjacente e recrutamento de fatores de transcrição que reconhecem essas HPTMs em locais específicos. As HPTMs são reguladas por três importantes classes de enzimas denominadas leitores - que reconhecem, gravadores - que depositam, e borrachas - que removem HPTMs. Assim, o recrutamento ou dissolução de enzimas leitoras, escritoras ou borrachadoras pode, em última instância, alterar a paisagem das HPTMs e governar a estrutura e a função da cromatina, tornando sua regulação e leitura essenciais para o entendimento da biologia e função celular 3,4.
As células do sistema nervoso central (SNC) são epigeneticamente flexíveis à medida que mudam seu transcriptoma para se adaptar aos estímulos ambientais. Evidências acumuladas sugerem que alterações no epigenoma, como metilação do DNA, RNAs não codificantes e HPTMs, desempenham um papel essencial na formação da memória e na função sináptica5. Interromper a dinâmica HPTM por meio da manipulação dos leitores, escritores ou apagadores relevantes pode bloquear ou melhorar o aprendizado associativo e a potencialização a longo prazo 6,7,8. Microglia, a célula imune residente do SNC, regula rapidamente seu transcriptoma em resposta à estimulação imune através de mudanças dinâmicas em seu epigenoma 9,10,11. Esse alto nível de adaptação ao ambiente cerebral local os torna difíceis de serem examinados em um contexto isolado, pois estudos têm mostrado que o epigenoma e o transcriptoma da micróglia tornam-se alterados após apenas algumas horas em meios de cultura após a remoção do ambiente cerebral11. Além disso, como a microglia representa apenas 10% das células cerebrais, as medidas que examinam as alterações em todo o nível tecidual carecem de sensibilidade e especificidade12,13. Como resultado, a microglia precisa ser rapidamente isolada para examinar as alterações epigenéticas, como os níveis de HPTM, ex vivo.
Os métodos comumente usados para examinar HPTMs incluem o sequenciamento por imunoprecipitação com cromatina (ChIP-seq) e a clivagem sob alvos e o sequenciamento por tagmentação (CUT&Tag-seq)4. Embora essas técnicas sejam altamente específicas para uma HPTM individual e possam informar a presença de HPTMs dentro de um contexto genômico específico, elas só podem examinar uma das muitas HPTMs possíveis dentro de um único experimento 11,14 Portanto, antes de prosseguir com tais experimentos, que requerem um investimento significativo de tempo e dinheiro, é altamente valioso restringir a lista de HPTMs potencialmente interessantes para uma investigação mais aprofundada, examinando primeiro as mudanças no mercado global níveis de HPTMs. As duas principais abordagens para examinar os níveis globais de HPTM são a imunohistoquímica e a análise de western blot, mas ambas as abordagens são apenas semiquantitativas, de baixo rendimento e requerem grande número de cortes teciduais ou células isoladas15,16. Assim, nosso objetivo foi desenvolver um método quantitativo altamente sensível que pudesse ser usado para examinar os níveis globais de HPTM rapidamente e em nível de célula única.
O protocolo apresentado permite a detecção rápida dos níveis globais de HPTM por meio da citometria de fluxo intranuclear. Estudos prévios em células cancerosas justificaram a importância de examinar os níveis globais do ponto de vista clínico17,18. Também é comum que estudos utilizem níveis globais como método de triagem antes de avaliar a localização genômica de HPTMs específicas de interesse19,20. Para a micróglia, avaliar os níveis globais após o isolamento é um desafio devido ao baixo rendimento celular; Pan et al apresentam níveis globais de HPTM a partir de micróglia isolada, na qual a micróglia de três animais foi agrupada para permitir a detecção do nível de proteína por western blot19. Usando nosso protocolo, somos capazes de detectar mudanças globais com entradas de células muito menores, permitindo a triagem de várias marcas por animal e eliminando a necessidade de agrupar amostras.
Aqui, descrevemos um protocolo para detectar rapidamente os níveis de HPTM através de citometria de fluxo intranuclear quantitativa em microglia isolada. Embora nos concentremos especificamente na quantificação de HPTM por uma questão de brevidade, este protocolo pode ser usado da mesma maneira para quantificar os níveis globais de enzimas leitoras, escritoras e borrachadoras. O protocolo é entregue em duas partes: primeiro, o método de isolamento para micróglia e, segundo, o método baseado em citometria de fluxo para determinar os níveis de HPTM. O método de isolamento produz células que podem ser usadas tanto para o isolamento de RNA quanto para a avaliação do nível de HPTM, o que permite a avaliação da expressão gênica e dos níveis de HPTM a partir de uma mesma amostra. Além disso, o método de avaliação de HPTM pode ser usado em outros tipos de células, conforme indicado no protocolo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Not Treated Plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl Histone 3 K9 (C5B11)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>9649S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl Histone H4 K8 (2594)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>2594S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>8173S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA523516</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>15021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>2222S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (tri methyl K4)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab213224</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb</td>
			<td>PTM Biolabs</td>
			<td>PTM-1411RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb</td>
			<td>PRM Biolabs</td>
			<td>PTM-1401RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>848006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyto-Last Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide, sterile</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>12611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Mouse AlexaFluor488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-546-150</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AS035</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>406410</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB12566502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K18ac Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>720095</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6002</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb</td>
			<td>PTM BIolabs</td>
			<td>PTM-1406RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>LK003178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC57004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptolide</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>97539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Nuclear Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>424401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>156604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of global histone post translational modifications using intranuclear flow cytometry in isolated mouse brain microglia

O controle da expressão gênica ocorre parcialmente por modificações na estrutura da cromatina, incluindo a adição e remoção de modificações pós-traducionais nas caudas das histonas. As modificações pós-traducionais de histona (HPTMs) podem facilitar a expressão gênica ou a repressão. Por exemplo, a acetilação de resíduos de lisina da cauda de histona neutraliza a carga positiva e reduz as interações entre a cauda e o DNA carregado negativamente. A diminuição das interações histona-cauda-DNA resulta em maior acessibilidade do DNA subjacente, permitindo maior acesso ao fator de transcrição. A marca de acetilação também serve como um local de reconhecimento para ativadores transcricionais contendo bromodomínio, resultando juntos em maior expressão gênica. As marcas de histona podem ser reguladas dinamicamente durante a diferenciação celular e em resposta a diferentes ambientes e estímulos celulares. Embora as abordagens de sequenciamento de próxima geração tenham começado a caracterizar locais genômicos para modificações individuais de histonas, apenas uma modificação pode ser examinada simultaneamente. Dado que existem centenas de HPTMs diferentes, desenvolvemos uma medida quantitativa de alto rendimento de HPTMs globais que pode ser usada para rastrear modificações de histonas antes de conduzir abordagens mais extensas de sequenciamento genômico. Este protocolo descreve um método baseado em citometria de fluxo para detectar HPTMs globais e pode ser conduzido usando células em cultura ou células isoladas de tecidos in vivo . Apresentamos dados de exemplo de microglia cerebral isolada de camundongos para demonstrar a sensibilidade do ensaio para detectar mudanças globais em HPTMs em resposta a um estímulo imune derivado de bactérias (lipopolissacarídeo). Este protocolo permite a avaliação rápida e quantitativa de HPTMs e pode ser aplicado a qualquer regulador transcricional ou epigenético que possa ser detectado por um anticorpo.

Epigenetics is the study of the mechanisms that regulate gene expression without altering the underlying DNA sequence. Epigenetic regulation of gene expression is dynamic within cells and can allow for rapid and coordinated responses to various environmental stimuli. The dynamic regulation occurs in part due to changes in the chromatin structure at the level of the nucleosome, which is comprised of histone proteins (H2A, H2B, H3, H4) assembled into an octamer core tightly wound by DNA1. The interactions between the histone proteins and the DNA can control the accessibility of DNA to transcription machinery, which can ultimately control gene expression and other aspects of chromatin biology2. Histone proteins have unstructured tails which feature positively charged residues that form electrostatic interactions with the negatively charged DNA backbone. These interactions result in tight packing of the DNA and reduced DNA accessibility. Covalent modifications to the histone tails, termed histone post-translational modifications (HPTMs), can regulate these interactions3,4. Some of the most well-characterized HPTMs include histone tail acetylation and methylation, which can change the affinity of electrostatic interactions between the histone tails and DNA, resulting in differential accessibility to the underlying DNA and recruitment of transcription factors which recognize these HPTMs at specific sites. HPTMs are regulated by three important classes of enzymes termed readers- which recognize, writers- which deposit, and erasers- which remove HPTMs. Thus, the recruitment or dissolution of reader, writer, or eraser enzymes can ultimately change the landscape of HPTMs and govern the structure and function of chromatin, making their regulation and readout essential for understanding cellular biology and function3,4.
The cells in the central nervous system (CNS) are epigenetically flexible as they change their transcriptome to adapt to environmental stimuli. Accumulating evidence suggests that changes in the epigenome, such as DNA methylation, non-coding RNAs, and HPTMs, play an essential role in memory formation and synaptic function5. Disrupting HPTM dynamics through manipulation of the relevant readers, writers, or erasers can block or enhance associative learning and long-term potentiation6,7,8. Microglia, the resident immune cell of the CNS, rapidly regulate their transcriptome in response to immune stimulation through dynamic changes in their epigenome9,10,11. This high level of adaptation to their local brain environment makes them difficult to examine in an isolated context as studies have shown that the epigenome and transcriptome of microglia becomes altered after only a few hours in culture media after removal from the brain environment11. In addition, as microglia only make up 10% of the brain&#39;s cells, measures examining changes at the whole tissue level lack sensitivity and specificity12,13. As a result, microglia need to be rapidly isolated to examine the epigenetic changes such as HPTM levels, ex vivo.
The methods commonly used to examine HPTMs include chromatin-immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) and cleavage under targets and tagmentation sequencing (CUT&#38;Tag-seq)4. While these techniques are highly specific to an individual HPTM and can inform the presence of HPTMs within a specific genomic context, they can only examine one of the many possible HPTMs within a single experiment11,14 Therefore, before proceeding with such experiments, which require a significant time and money investment, it is highly valuable to narrow down the list of potentially interesting HPTMs for further investigation by first examining changes in global levels of HPTMs. The two main approaches for examining global HPTM levels are immunohistochemistry and western blot analysis, but both approaches are only semi-quantitative, low-throughput, and require large numbers of tissue sections or isolated cells15,16. Thus, we aimed to develop a highly sensitive, quantitative method that could be used to examine the global HPTM levels rapidly and at the single cell level.
The protocol presented enables detection of global HPTM levels rapidly using intranuclear flow cytometry. Previous studies in cancer cells have justified the importance of examining global levels from a clinical perspective17,18. It is also common for studies to use global levels as a screening method prior to assessing genomic location of specific HPTMs of interest19,20. For microglia, assessing global levels following isolation is challenging due to the low cell yield; Pan et al present global HPTM levels from isolated microglia, in which microglia from three animals was pooled to enable protein level detection by western blot19. Using our protocol, we are able to detect global changes with much lower cell inputs, enabling screening of multiple marks per animal and eliminating the need to pool samples.
Here, we describe a protocol to detect HPTM levels rapidly via quantitative intranuclear flow cytometry in isolated microglia. While we focus specifically on HPTM quantification for the sake of brevity, this protocol can be used in the same way to quantify global levels of reader, writer, and eraser enzymes. The protocol is delivered in two parts: first, the isolation method for microglia and, second, the flow cytometry-based method for determining HPTM levels. The isolation method yields cells that can be used for both RNA isolation and HPTM level assessment which allows for the evaluation of gene expression and HPTM levels from the same sample. In addition, the method for HPTM assessment can be used on other cell types as indicated in the protocol.

Autor em destaque: Aprimoramentos na pesquisa de regulação da expressão gênica

Quantificação de modificações pós-traducionais globais de histona utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada de camundongos

Our research aims to understand the fundamental regulatory mechanisms controlling gene expression in the brain, and we're particularly interested in understanding how disruption of these mechanisms contributes to neurodevelopmental and neuropsychiatric conditions. We focus on understanding how genetic and environmental risk factors combined to alter cellular function and produce behavioral impairments. This protocol includes methods for high-throughput screening of histone modifications in isolated microglia, allowing us to screen through dozens of different epigenetic modifications before committing to high-throughput sequencing, and functional follow-up studies.Our protocol provides measures of global histo modifications similar to Western plot. However, our technique is both faster, requires fewer input cells, is more quantitative, and can be multiplexed.

Camundongos adultos foram perfundidos transcardialmente e sacrificados para isolamento da micróglia. Microglias foram isoladas no gelo e coradas com P2RY12-APC e violeta 525 anticorpos mortos vivos. As células que foram determinadas como positivas para P2RY12 e negativas para violeta 525 vivas mortas foram classificadas como micróglia viva. O rendimento médio de microglia de um cérebro dissecado de camundongo foi de 1,28 x 105 ± 0,05 (média ± erro padrão da média (EPM), N=100). Não há diferença no rendimento da micróglia em camundongos fêmeas (1,25 x 105 ± 0,09 [média ± EPM, N=46]) e machos (1,32 x10 5 ± 0,07 [média ± EPM, N=54]) (t(98)=0,6365, p=0,526). Ao isolar de regiões específicas do cérebro, o rendimento médio da micróglia de córtices de camundongos é de 8,3 x 104 ± 0,08 (média ± EPM, N=15) e do hipocampo de camundongos é de 4,1 x 104 ± 0,02 (média ± EPM, N=16). Como esperado, há uma diferença significativa no rendimento da microglia de cada região cerebral (F(2, 128)=25,25, P<0,0001). Após o isolamento da micróglia, o RNA foi extraído das células isoladas usando um kit de isolamento de RNA de baixa entrada. Consistentemente, o escore de integridade do RNA (NIR) foi acima de 9,0 (9,62 ± 0,05) e o rendimento médio de RNA por célula foi de 0,25 ± 0,01 pg (média ± EPM, N=32; Arquivo Suplementar S2).
Camundongos adultos foram injetados intraperitonealmente com 1 mg/kg de lipopolissacarídeo (LPS) 24 h antes do sacrifício. Os camundongos foram perfundidos transcardialmente com HBSS e a microglia isolada de todo o encéfalo de acordo com o protocolo descrito (Figura 5A). Para cada coloração, 20.000-30.000 células foram alocadas para cada painel de anticorpos. Os níveis globais de acetilação da lisina 27 da histona 3 (H3K27Ac) foram avaliados em micróglias isoladas por citometria de fluxo. Para camundongos machos e fêmeas, o tratamento com LPS induziu aumento de H3K27Ac quando o MFI é normalizado dentro do sexo (t(6)=9,676, p<0,0001; Figura 5B). Ao examinar os histogramas para as células coradas, as populações permanecem normalmente distribuídas com variação semelhante; no entanto, as células deslocaram-se para fluorescência aumentada, resultando no aumento do IFM (Figura 5C). Ao examinar H3K9Ac no mesmo tratamento, há um aumento semelhante em H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Figura 5D,E) no entanto, a mudança de dobra do LPS em relação ao PBS do sinal H3K9Ac é menor que o sinal H3K27Ac.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> Figura 5: Alterações globais na acetilação de histonas em micróglias isoladas. (A) Os camundongos são injetados intraperitonealmente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou lipopolissacarídeo (LPS) 1 mg/kg 24 h antes do sacrifício. As microglias são coletadas da fração enriquecida imune e fixadas para citometria de fluxo e avaliação pós-modificação pós-traducional de histonas. A intensidade fluorescente mediana é avaliada como proxy da expressão proteica. Criado com BioRender.com. (B) Os níveis globais de H3K27Ac aumentaram em resposta ao tratamento com LPS. Mudança de dobra para PBS normalizada dentro do experimento e sexo. Teste t bicaudal não pareado, t(6)=9,676, p<0,0001. O gráfico de barras mostra a média ± EPM. N=8 animais; 2 por condição em 2 experimentos independentes. (C) Exemplo de histogramas que mostram o desvio da intensidade fluorescente de H3K27Ac. Modal descreve histogramas de camundongos injetados com PBS versus LPS. (D) Exemplo de histogramas que mostram o desvio da intensidade fluorescente de H3K9Ac. Modal descreve histogramas de camundongos injetados com PBS versus LPS. (E) Os níveis globais de H3K9Ac aumentaram em resposta ao tratamento com LPS. Mudança de dobra para PBS normalizada dentro do experimento e sexo. Teste t bicaudal não pareado, t(6)=7,299, p=0,0003. O gráfico de barras mostra a média ± EPM. N=8 animais; 2 por condição em 2 experimentos independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para confirmar que o método descrito era comparável a outros métodos previamente utilizados para quantificação global de modificação de histonas, nosso objetivo foi usar o immunoblot como ferramenta comparativa. No entanto, o rendimento da micróglia isolada é simplesmente demasiado baixo para permitir uma avaliação razoável. Portanto, usamos células BV2 cultivadas para comparar o método de citometria de fluxo intracelular com um Western blot (WB). As células BV2 foram cultivadas em meio completo (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicilina/estreptamicina e 1x L-glutamina) a 37 °C, 5% CO2. As células foram passadas com tripsina-EDTA a 0,25% e plaqueadas a uma densidade de 250.000 células/poço e tratadas em meios séricos reduzidos (DMEM F12, 2% FBS, 1x penicilina/estreptamicina e 1x L-glutamina) e deixadas recuperar por 12 h a 37 °C, 5% CO2. As células foram tratadas com 25 ng/mL de LPS por 24 h antes da fixação, como descrito acima, ou lise com um tampão de lise WB. O sinal de H3K27Ac foi realizado por ambos os métodos, sendo o GAPDH utilizado como controle de carga para WB. A análise da intensidade fluorescente normalizada em relação ao controle PBS foi determinada para cada grupo (Figura 6A). Ao examinar a mudança no sinal H3K27Ac normalizado pelo WB, houve um aumento de 1,527 vezes na condição tratada com LPS em relação ao controle H2O, que foi determinado como significativo pelo teste t não pareado (t=3,024, df=5; p=0,0293). Ao examinar a alteração por citometria de fluxo, houve um aumento de 1,482 vezes na condição tratada com LPS, que foi determinado como significativo (t=7,843, df=10; p<0,0001). Usando uma ANOVA de 2 vias para comparar os métodos, determinou-se que houve um efeito significativo do tratamento (F(1,15)=45,21,p<0,0001), mas não do método (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) ou interação (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Além disso, verificamos aqui que não há alteração nos níveis de histona H3 tanto pelo Western blot quanto pela citometria de fluxo, pois a ANOVA de 2 vias não revelou efeito significativo do tratamento com LPS (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), do método (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) ou da interação (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Figura 6B). Exemplos de manchas e deslocamentos de histograma para esses dados também são mostrados (Figura 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> Figura 6: Comparação de métodos para quantificação da mudança global de modificação de histonas entre citometria de fluxo e western blot. (A) As células BV2 são tratadas com 25 ng/mL de lipopolissacarídeo (LPS) ou H2O por 24 h antes da análise. A intensidade fluorescente de H3K27Ac é descrita como mudança de dobra para o veículo controle, solução salina tamponada com fosfato (PBS), tanto para citometria de fluxo quanto para western blot. A ANOVA de 2 vias revelou efeito significativo do tratamento com LPS (F(1,15)=45,21, p<0,0001), mas não do método (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) ou interação (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). A correção de Tukey para testes de hipóteses múltiplas foi aplicada para os resíduos. * apresenta 0,0332, ** apresenta 0,0021. (B) A intensidade fluorescente para a histona H3 é descrita como mudança de dobra para PBS tanto para citometria de fluxo quanto para western blot. A ANOVA de 2 vias não revelou efeito significativo do tratamento com LPS (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) ou do método (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) ou da interação (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Exemplos de coágulos e (D) deslocamentos de citometria de fluxo são retratados. O tamanho do histograma é normalizado para porcentagem com base no número de células presentes na intensidade fluorescente do modo. O gráfico de barras mostra a média de EPM.n=2 experimentos independentes, 2 por condição por experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Em conjunto, esses resultados mostram que esta técnica pode ser usada para avaliar quantitativamente os níveis globais de HPTM em micróglias isoladas. Além disso, o método mostrou-se comparável às técnicas anteriores, mas exigindo entradas celulares muito menores. Além disso, enquanto não demonstrada, com a devida compensação, a presente técnica pode ser utilizada com múltiplos anticorpos no mesmo painel avaliando diferentes HPTMs.
Arquivo suplementar S1: arquivos de análise de exemplo. Este arquivo contém um arquivo de análise wsp e 7 arquivos fcs, incluindo o sem mancha, P2RY12FMO, 568FMO, dois animais tratados com PBS e dois animais tratados com LPS corados com H3K27Ac. O objetivo deste arquivo é demonstrar a análise e o fechamento de um experimento que poderia retratar como foi um experimento bem-sucedido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar S2: Dados de isolamento. O arquivo incluído contém os dados relevantes pós-classificação da micróglia que contém o rendimento da micróglia e do RNA do protocolo descrito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>CONDOMÍNIO FECHADO</td>
			<td>Frequência dos pais</td>
			<td>Frequência do Total</td>
			<td>Contar</td>
		</tr><tr><td>E1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>S2>S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ > S2 > S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ > APC+ > S2 > S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Exemplo de gráfico de linhagem de amostra mostra números de porcentagem e eventos necessários para a detecção precisa de proteínas.

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancements in Gene Expression Regulation Research at JoVE.com

Este trabalho descreve um protocolo para quantificação de modificações globais de histonas utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada. O trabalho também contém o protocolo de isolamento da micróglia que foi utilizado para a coleta de dados.

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Nossa pesquisa visa entender os mecanismos regulatórios fundamentais que controlam a expressão gênica no cérebro, e estamos particularmente interessados em entender como a interrupção desses mecanismos contribui para condições neurodesenvolvimentais e neuropsiquiátricas. Nosso foco é entender como fatores de risco genéticos e ambientais se combinam para alterar a função celular e produzir prejuízos comportamentais. Este protocolo inclui métodos para triagem de alto rendimento de modificações de histonas em micróglias isoladas, permitindo-nos rastrear dezenas de diferentes modificações epigenéticas antes de nos comprometermos com o sequenciamento de alto rendimento e estudos de acompanhamento funcional.Nosso protocolo fornece medidas de modificações histológicas globais semelhantes ao gráfico ocidental. No entanto, nossa técnica é mais rápida, requer menos células de entrada, é mais quantitativa e pode ser multiplexada.

quantification-global-histone-post-translational-modifications-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

633 visualizações.  University of British Columbia. Nossa pesquisa visa entender os mecanismos regulatórios fundamentais que controlam a expressão gênica no cérebro, e estamos particularmente interessados em entender como a interrupção desses mecanismos contribui para condições neurodesenvolvimentais e neuropsiquiátricas. Nosso foco é entender como fatores de risco genéticos e ambientais se combinam para alterar a função celular e produzir prejuízos comportamentais. Este protocolo inclui métodos para triagem de alto rendimento d...

Vídeo: Autor em destaque: Aprimoramentos na pesquisa de regulação da expressão gênica

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

Neurociência

Mouse Brain Dissection for Microglia Isolation

Begin by placing the isolated mouse brain tissue in 1 milliliter of digestion buffer per brain in separate Petri dishes on ice. Thoroughly chop the brain tissues into small pieces using a clean scalpel blade. Using a plastic transfer pipette with its tip cutoff, carefully transfer minced brains into individual wells inside a 24-well plate on ice.Cover the plate with a large piece of transparent, flexible film, close the lid, and incubate on ice for 30 minutes. Next, transfer the digested brain solution into individual 7-milliliter iced glass dounce homogenizers on ice containing 5 milliliters of cold FACS buffer. Gently dounce each brain with a loose pestle until a single-cell suspension is obtained.Softly dounce with the tight pestle three to four times to ensure a single-cell suspension before transferring to 15-milliliter polypropylene tubes.

Dissecção Cerebral de Camundongo para Isolamento de Microglia

Mouse Brain Immune-Enriched Fragment Isolation for Histone PTM Quantification

Begin by adding 2.125 milliliters of isotonic density gradient to a 15 milliliter polypropylene tube containing murine brain homogenate. Top up each tube with fax buffer to a final volume of 8.5 milliliters. Gently invert the tubes 20 times to mix thoroughly.Using a narrow graduated transfer pipette, gently underlay four milliliters of pink, 37%density gradient establishing two clean layers. Switch transfer pipettes and underlay two milliliters of the blue, 70%density gradient below the 37%layer. Transfer the tubes to a centrifuge cool to four degrees Celsius and spin them at 500 G for 20 minutes with the braking ramp set to the lowest setting.After centrifugation, discard the myelin from the top of the 15 milliliter tube using a clean transfer pipette. Carefully collect the top fragment of the density gradient into a clean 15 milliliter polypropylene tube using another transfer pipette. Next, gather all cells in the sample by slowly circling the pipette along the sides of the tube while collecting the immune enriched fragment.Transfer the immune enriched fragment into a new 15 milliliter polypropylene tube. Wash the sample by adding 10 milliliters of fax to the tube. Gently invert the tube 20 times to mix thoroughly.Spin the tubes in a cooled centrifuge with the braking ramp set to the lowest setting to pellet the isolated immune cells.

Isolamento de Fragmentos Enriquecidos Imunologicamente Cerebrais em Camundongos para Quantificação de PTM Histone

Mouse Brain Enriched Immune Pellet Plate Staining Method for Histone Quantification

Transfer a mouse brain enriched immune pellet from a 15-milliliter tube to a round bottom 96-well plate. After centrifuging the plate at 500 G for five minutes, Remove the supernatant by flicking. Resuspend the cells in 100 microliters of FACS buffer, then transfer 10 microliters from each well into the control wells.Centrifuge at 500 G for five minutes. After removing the supernatant from the centrifuged cells, add 50 microliters of double concentration FC block. Incubate for 10 minutes on ice.Now add 50 microliters of the antibody master mix at double the final desired concentration and incubate it on ice in the dark. Then, add 200 microliters of the FACS buffer to each well and centrifuge at 500 G for five minutes. Discard the supernatant by flicking, then wash the cells in 300 microliters of FACS buffer.Centrifuge and resuspend the cells in 200 microliters of FACS buffer. Finally, transfer the suspension to a flow sort tube containing 300 microliters of FACS buffer.

Método de coloração de placa de pelota imune enriquecido com cérebro de camundongo para quantificação de histona

Flow Cytometry and Data Analysis of Murine Brain Histone Post-Translational Modifications

Analyze the antibody panel, confirm that the cytometer has a minimum of four lasers, including red, yellow, blue, and violet. Establish the compensation matrix with either compensation beads or single stain cell controls. To calibrate and standardize, run rainbow fluorescent beads at the beginning of each experiment by adjusting the photomultiplier tube voltage until the bead peaks align with the target values from the previous experiments.Set the photomultiplier tube voltage and gain for the experiment. Then use antibody captured compensation beads to establish a compensation matrix. Next, plot the side scatter area on log versus the forward scatter height on linear in a dot plot, gate out debris and select for cell size using the S1 gate, choose singlet cells in a dot plot a forward scatter width versus forward scatter height with S2 gate.For establishing floor four gates, use the relevant FMO for each floor four channel. With single parameter histograms determine the positive signal in each channel and establish the gates accordingly. Carefully record the samples using the established gating strategy.Identify microglia using P2 RY 12 plus signal and determine protein expression in the respective channel for microglia only. Establish analysis gates on the cytometer analysis software user interface by replicating the same gating strategy used during recording. Use the add statistics function to select the median for the population of interest on the compensated channel height.Export the MFI values for the respective channels to a spreadsheet using the table editor for further statistical analysis. Lipopolysaccharide treatment induced an increase in histone three lysine 27 acetylation. When the MFI is normalized within sex, histogram analysis of the stained cells showed normally distributed populations with cell shifts to increased fluorescence.A similar increase in histone three lysine 27 acetylation was seen in the stained cells.