Desenvolvemos uma metodologia de mapeamento FRET que permite a identificação e caracterização de sítios de ligação de ligantes, orientação subunita, alterações conformais associadas à ligação de ligantes e movimentos dinâmicos de proteínas. Uma vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada em solução e as moléculas podem se mover livremente. As distâncias medidas por essa técnica são apropriadas para sistemas biológicos.
O FRET é amplamente aplicável a muitos sistemas. O mapeamento melhora o monitoramento de mudanças estruturais e dinâmicas em qualquer sistema biomolecular, e é particularmente eficaz se houver informações estruturais tridimensionais. Depois de purificar a proteína, a parte mais difícil é rotular com alta eficiência e remover o corante livre.
Para os experimentos, ajuda ter o mínimo de corante livre possível. Para começar, escolha locais de rotulagem dentro de 25 a 75 angstrom do local de ligação punitiva, e em regiões relativamente estáticas da proteína. A distância determinará o par de corante FRET específico a ser usado.
Localize os locais de rotulagem em regiões proteicas relativamente distintas umas das outras. Assim, os locais descrevem os vértices de um triângulo, com o local de ligação punitiva localizado no centro. Para medir os valores de R0, dependendo do tamanho e volume desejados da cuvette, prepare duas amostras de proteína na mesma concentração de proteína total.
Uma com a proteína rotulada apenas com o corante doador, e outra com a proteína rotulada apenas com o corante aceitador. Ligue o fluorômetro e abra o programa de aquisição e análise espectral no software FluorEssence, se estiver usando um espectrômetro. Clique no M vermelho para conectar o computador ao instrumento e escolha espectros de emissão.
Digite parâmetros de varredura usando o item do menu de teste de coleta, como comprimento de onda de excitação, a faixa para varredura de emissões, temperatura e amostra mudam sua posição. Clique no RTC e nas configurações otimizadas do instrumento, conforme descrito no manuscrito, monitorando a emissão de fluorescência no pico usando um comprimento de onda de excitação definido no máximo de absorção do corante. Coloque a amostra de proteína rotulada pelo doador no suporte da amostra, e clique para gerar uma varredura de emissão da proteína rotulada apenas com o corante doador, excitando a amostra no máximo de absorção de corantes, e escaneando sobre o pico de emissão.
Estabeleça uma linha de base para a varredura estendendo a varredura em 25 a 50 nanômetros após o final do pico. Meça o rendimento quântico da proteína do doador apenas realizando absorções e medições de fluorescência em amostras de diferentes concentrações, conforme descrito no manuscrito do texto. Prepare apenas proteínas, proteínas aceitadoras e amostras de proteínas aceitadoras de doadores, na mesma concentração.
Obtenha o doador apenas para gerar espectros de emissão de fluorescência. Excite a solução no máximo de absorção de corantes doadores e escaneie os picos de emissão do doador e do aceitador. Ou troca a amostra apenas pela proteína aceitadora, ou altera a amostra muda sua posição para a cuvette que contém apenas proteína aceitadora.
Obtenha uma varredura de emissão da proteína rotulada apenas com o corante aceitador. Excite a amostra no comprimento de onda de excitação do doador. Troque a amostra para a amostra de proteína aceitadora do doador ou altere a amostra mude sua posição para a cuvette contendo a proteína rotulada do doador.
Obtenha uma varredura de emissão da amostra de proteína aceitadora de doadores usando as mesmas configurações. Para todos os espectros, corrija a fluorescência de fundo subtraindo as contagens de fundo medidas no final da varredura. Use um programa de visualização gráfica 3D, como o PyMOL, para mapear as distâncias na estrutura, inserindo diretamente os comandos do script na janela de comando com as informações de distância apropriadas.
Gere uma concha para cada distância medida e o erro associado. Mapeie a posição através da intersecção das diferentes conchas. O local de ligação do peptídeo de sinal foi mapeado usando três locais diferentes na SecA e SecYEG, e quatro locais diferentes no peptídeo de sinal.
Experimentos de FRET entre diferentes regiões da pré-proteína e três locais distintos nas proteínas SecA e SecYEG mapeiam o local de ligação pré-proteína e orientação. O local de ligação punitiva do peptídeo de sinal foi previamente identificado como o dedo de duas hélices, e a cauda terminal C da SecA sugeriu uma orientação paralela ao dedo de duas hélices. Foram obtidos espectros de FRET de estado constante entre SecA37 e PhoA2 e PhoA22.
A redução da intensidade do doador indicou maior transferência de energia a partir de PhoA22. Em relação ao site PhoA2, que está localizado mais longe da SecA37. Os espectros de decadência de fluorescência resolvidas demonstraram que o complexo aceitador de doadores tem uma decadência homogênea mais curta consistente com a transferência de energia associada a uma distância.
As conchas de distância FRET construídas entre o resíduo SecA PhoA2, e os locais triangulados, demonstraram que cada concha se cruza com o dedo de duas hélices, o local de ligação presumido, que é mostrado em verde. A área intersetorial é menor do que cada concha FRET e inclui uma grande contribuição do andaime helicoidal. Conchas de distância FRET determinadas entre o resíduo PhoA2 e os locais rotulados, descrevem uma área menor localizada mais próxima da ponta do dedo de duas hélices e da boca do canal SecYEG.
Esta área interseccionada está situada na extremidade oposta do dedo de duas hélices de PhoA2. Coisas importantes a considerar incluem a seleção adequada dos sites de rotulagem para triangular a área de interesse, medir os rendimentos quânticos para cada site e remover todo o corante livre. Este método se alinha com informações estruturais obtidas com métodos como NMR ou cristalografia de raios-X.
Quando os resultados do FRET são colocados em um contexto estrutural, ele pode melhorar as informações existentes.
