Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant GM094246, a American Heart Association Grant 11GRNT7890004, ea National Science Foundation Grant MCB-1110501.

1 Criar a construção contendo a proteína de interesse Clonar o gene que expressa a proteína de interesse num vector adequado. Utilização de vectores como os da série pcDNA ou pRK5 como eles estão bem adaptados para a expressão em sistemas de mamífero, como as células CHO e HEK293. 2 Selecione os locais da proteína a ser identificada com o fluoróforos <ol><li> Escolha locais de etiquetagem que é capaz de reflectir as alterações conformacionais possíveis dentro da proteína. Se possível, utilizar uma estrutura de cristal da proteína ou de uma proteína homóloga para ajudar a fazer esta determinação. Se não há estrutura de cristal disponível, utilizar o software on-line para prever a estrutura possível da proteína e, consequentemente, receber uma visão em locais apropriados. </li><li> Escolha resíduos de tal modo que as cadeias laterais de resíduos seleccionados são superfície exposta e acessível para os fluoróforos de modo que a proteína pode ser marcada. <ol><li> Escolha resíduos quenão são críticas para a função da proteína, por exemplo, os locais que não estão envolvidos na ligação do ligando. </li><li> Ao apresentar mutação cisteína, dê preferência a sites que são semelhantes, por exemplo, serina, que causariam perturbação mínima para a estrutura da proteína. </li><li> Depois de escolher os locais de rotulagem, faça as mutações para garantir que a proteína só dá lRet destes locais pretendidos. Use protocolos padrão de mutagénese dirigida ao local de mutação de distância cisteínas não-ligadas por dissulfureto, que poderia, potencialmente, se ligam a maleimida conjugados marcadores fluorescentes. Não mutar distância cisteínas ligadas por dissulfureto e enterrado, cisteínas livres uma vez que eles não devem reagir com corantes fluorescentes sob a forma dobrada da proteína. </li></ol></li><li> Introduzir os resíduos de cisteína nos locais desejados, fazendo mutações pontuais utilizando protocolos padrão de mutagénese dirigida ao local. </li><li> Incluir um sítio de clivagem de protease que pode clivar especificamente fora de uma das cisteínas da proteína. Se osequência de proteína permite por isso, introduzir o sítio de mutação conservadora que a proteína tem um trombina (LVPRGS sequência de reconhecimento) ou Factor Xa (IDGR sequência de reconhecimento ou IEGR) sequência perto da cisteína introduzido e acessível a protease de clivagem; caso contrário, a sequência de tetra ou hexa-peptídeo pode ser inserido como um todo. Escolha do local de modo a que após a clivagem de um dos cisteínas introduzidas dissocia-se do resto da proteína, em certos casos, isto pode exigir dois locais de clivagem que flanqueiam uma cisteína mutado. </li></ol> 3 Teste a expressão e funcionalidade da proteína <ol><li> Realizar um western blot para confirmar a expressão da proteína mutada. </li><li> Executar um ensaio funcional da proteína para assegurar que as mutações alteraram a função de proteína apenas minimamente, se de todo, para evitar alterações da conformação de estudar uma proteína disfuncional. NOTA: Uma vez que todas as proteínas têm funções diferentes, não existe um único f<html> ensaio unctional que é usado especificamente para lRet; no entanto, alguns exemplos de ensaios funcionais incluem ensaios enzimáticos de atividade das enzimas, ensaios de ligação ao ligando para os receptores, e os estudos de eletrofisiologia para canais iônicos. </li></ol> 4 Selecione os fluoróforos para ser usado Seleccionar fluoróforos com base no intervalo distância esperada a ser medido de tal forma que o intervalo se situa entre o 0.5-1x R 0 do par de fluoróforo. NOTA: Isto permite uma mais fácil subtração do fundo, que normalmente tem vida útil muito mais tempo. Por exemplo, se o intervalo esperado distância a ser medida é de cerca de 35 A, um par de fluoróforo adequado para utilizar seria quelato térbio como o dador e Alexa 594 como o aceitador, uma vez que o R 0 para este par é de 53 Â (Tabela 1). 5. expressar a proteína por transitoriamente transfecção a quantidade necessária de células de mamíferos ntent &quot;&gt; transfectar transitoriamente a proteína de interesse nas células de mamífero escolhidas utilizando qualquer um dos reagentes de transfecção comuns Tipicamente, utilizar quatro placas de 10 cm por experimentação lRet para linhas de células HEK e CHO;. no entanto, esta quantidade pode variar dependendo da proteína de expressão , estabilidade, etc. Permitir que as células para expressar a proteína de 36-48 horas antes da colheita. 6 Nomeie as proteínas <ol><li> Separar as células do prato de cultura. Separar as células HEK, bastando pipetando tampão contra a parte inferior do prato. Retire células CHO com um raspador de células, lavando os meios de comunicação com tampão extracelular. </li><li> Recolher as células por centrifugação a 1100 xg durante 3 min. Use essas mesmas configurações de centrífuga para a recolha de células após marcação, assim como após as lavagens posteriores. </li><li> Suspender as células em 3 ml de tampão extracelular, em seguida, adicionar dadores e aceitadores fluoróforos em quantidades equimolares até uma concentração final de 100-300 nM. Incubar num rotor fou de 1 hora a RT. </li><li> Lave as células marcadas com 3-4 x tampão extracelular para remover fluoróforos não ligados, em seguida, suspender as células em tampão extracelular (normalmente 2 ml) para medições lRet. </li><li> Como um controlo, rotular um conjunto separado de células com apenas fluoróforo dador (quelato térbio), sem adição de qualquer fluoróforo aceitador. NOTA: Os dados destes experimentos só por doadores é necessária para completar a análise. Estas experiências podem ser feitas no mesmo ou em dias diferentes. </li><li> Mais uma vez, realizar a validação funcional, desta vez com a proteína mutante rotulados, como o processo de rotulagem também pode interferir com a função, dependendo do local utilizado para a rotulagem. NOTA: Estas experiências podem ser feitas no mesmo ou em dias diferentes. </li></ol> 7 Configure o Experimento lRet <ol><li> Colocar as células ressuspensas em uma cuveta de quartzo com um volume mínimo de 1 ml. </li><li> Ligue o computador eo instrumento e ajustar os parâmetros da datum programa de aquisição de conformidade. <ol><li> Definir o comprimento de onda de excitação para a gama de absorvância do fluoroforo doador (330-340 nm, funciona bem para quelato térbio). </li><li> Definir o comprimento de onda de emissão de forma adequada, tendo em conta que a emissão de aceitador varia de acordo com o receptor utilizado. Importante, selecione um comprimento de onda de detecção, que mede apenas a emissão aceitante e não inclui qualquer sangria através da emissão do doador. Por exemplo, usar um comprimento de onda de 565 nm para a Alexa 555 como um aceitador Tabela 1. Para medições só-doador, em que a proteína foi marcado apenas com dador, mas sem aceitador, usar um comprimento de onda de 545 nm para medir a emissão de quelato térbio. </li><li> Defina o período de detecção de emissão a ser, pelo menos, três vezes o tempo de vida lRet esperado para garantir que um componente de longo tempo de vida não vai ser desperdiçada. </li></ol></li><li> Realize a verificação. Fazer pelo menos três exames de 99 varreduras para garantir a consistência dos resultados. Salve ªe resultados como um arquivo de texto (* txt). </li><li> Para medir mudanças de conformação de uma proteína no que diz respeito a diferentes condições (como a adição de um ligante), alterar essas condições e, novamente, realizar pelo menos três exames de 99 varreduras cada na mesma amostra sob esta nova condição. Se a estudar os efeitos do glutamato na conformação dos receptores de glutamato, por exemplo, adicionar a glutamato 1 mM para a mesma amostra digitalizada no passo 7.3, e então examinar novamente. </li><li> Adicionar até cinco unidades da protease adequada e tomar exames continuamente até que a clivagem é completa e nenhuma mudança é visto na vida de três exames sucessivos. Habitualmente, a clivagem fica completa em duas a três horas. Se um local de clivagem do Factor Xa está a ser utilizado para a clivagem de protease, por exemplo, adicionar 3 mL de Factor Xa à amostra, e digitalizar a cada 30 min durante 3 horas. </li></ol> 8 analisar os dados obtidos <ol><li> Abra o software de análise de dados. </li><li> Coloque o tempo de vida de fluorescênciadados usando Import ASCII para abrir os arquivos de texto. Coloque todas as repetições, bem como as medições de fundo finais, em um único arquivo. </li><li> Calcule a média dos dados de todas as verificações para cada condição experimental para obter os dados finais. Para fazer isso, selecione as colunas que contêm os ensaios individuais, então sob o menu Dados da barra de menu, clique em Estatísticas sobre linhas para exibir a intensidade média de fluorescência dos ensaios, bem como o desvio padrão e erro padrão. </li><li> Traça-se os valores médios, como um gráfico de linhas com intensidade de fluorescência no eixo dos Y e tempo de vida em microssegundos sobre o eixo-X para criar uma curva que representa a duração de emissão do aceitador sensibilizados. Alterar o eixo Y do plano para uma escala logarítmica, para permitir uma melhor visualização dos dados. </li><li> Repita o passo 8.3 sobre os dados de medição de fundo, a média dos exames finais que mostram sobreposição indicando clivagem completa. </li><li> Mostrar os dados de base médios nomesmo lote que contém os dados brutos em média. Para fazer isso, abra a caixa de diálogo Controle de Camada encontrado no menu Plot. Em seguida, transferir os dados que contêm o fundo significa para a lista de conteúdo da camada. </li><li> Alinhe os dados de base médios para os dados brutos médios. Para fazer isso, use a função matemática simples no menu Math para multiplicar ou dividir os dados de base, conforme necessário, até o fim da cauda da base coincide com a extremidade da cauda dos dados brutos. NOTA: Neste finalzinho, a vida útil da proteína de interesse já deve ter totalmente deteriorado longe; que está alinhada é simplesmente o sinal de fundo presente antes e depois de clivagem de protease. </li><li> Subtrair o sinal de fundo alinhado a partir do sinal inicial lRet cru, novamente usando a função matemática simples. </li><li> Coloque os dados para um decaimento exponencial (exponenciais simples ou múltiplos, dependendo dos locais e do projeto experimental). <ol><li> Definir o limite de início para montagem para começar após o fimdo impulso de laser. Use esse mesmo ponto inicial para todos os ajustes de curvas seguintes. </li><li> Na caixa de diálogo Selecionar Função de adaptação, selecione decaimento exponencial, de modo a se ajustar à vida com a seguinte equação para um único decaimento exponencial: <img alt="Equação 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200" /> Eq. 4 em que, y representa a intensidade de fluorescência, y 0 representa a intensidade de fundo, devido ao ruído do sistema, A 1 representa a intensidade do sinal, t é o tempo de vida da fluorescência, x é o tempo e x 0 é o desfasamento de tempo. </li><li> Corrigir x 0-0, iniciar a função de montagem, e ajustar os dados. NOTA: Se o experimento é projetado para ter sinal apenas de um par de sites, os dados resultantes devem ser facilmente fit por um único decaimento exponencial 8. O residual do ajuste é um bom método para determinar a bondade do ajuste e se vidas decaimento adicionais são required. </li></ol></li><li> Usar os tempos de vida obtidas a partir dos dados para calcular a distância entre os fluoróforos, utilizando a equação de Förster (um rearranjo das equações 1 e 2 acima): <img alt="Equação 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200" /> Eq. 5 Nota: Todas as variáveis ​​são como mencionado acima, com τ DA tendo sido medido como o tempo de vida de emissão aceitante sensibilizado. Mais detalhes e exemplos de medidas de R 0 e R podem ser encontrados em outros lugares 7,9,10. </li><li> Repita o experimento e análise de dados, pelo menos, três vezes para garantir a reprodutibilidade. Inconsistência entre as repetições individuais da mesma medida põe em causa a validade dos dados; usar experimentos de controle adicionais ou repetições. Calcule erros de medição utilizando o Gustavus calculadora livre análise de erros (desenvolvido pelo Dr. Thomas Huber) ou um sistema semelhante que se propaga o erro nose encaixa da vida. </li></ol>

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	<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes.">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate:+improvements+on+fluorescence+energy+transfer.">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li><li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium.">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li><li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates:+part+2.">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li><li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor.">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li><li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel.">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor.">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+(NMDA)+receptors.">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li><li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbium(III)+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors.">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

LRet é uma técnica poderosa que permite aos cientistas para medir as distâncias entre os domínios dentro de uma única proteína, bem como entre as subunidades de uma proteína multimérica. Como tal, lRet é bem adequado para examinar as alterações da conformação e da dinâmica de proteínas ou outras macromoléculas. O protocolo acima deve permitir que o laboratório devidamente equipado para testar facilmente suas hipóteses; no entanto, existem muitas fontes comuns de erro que podem flagelar o novo investiga...

Transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) é um derivado do conhecido Transferência de fluorescência Resonance Energia (FRET) técnica 1. Semelhante a FRET, lRet pode ser usado para medir as distâncias e as alterações da distância entre dador e aceitador fluoróforos ligados a sítios específicos da proteína de interesse dentro do intervalo de 10-100 Â 1-3. Os princípios da lRet também são semelhantes aos FRET em que a transferência de energia de ressonância ocorre entre dois fluoróforos proximais quando o espectro de emissão do fluoróforo dador sobrepõe-se com o espectro de absorção do fluoróforo aceitador. A eficiência de transferência este está relacionado com a distância entre os dois fluoróforos pela seguinte equação: <img alt="Equação 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" /> Eq. 1 onde R é a distância entre os dois fluoróforos, E é a eficiência de energy transferência, e R 0, discutida abaixo, é o raio de Förster para o par de fluoróforo, ou seja, a distância à qual a eficiência de transferência é metade do máximo. A partir desta equação, vê-se que a eficiência está relacionada com a grandeza da distância de elevado à sexta potência inversa 1. É este sexto dependência da potência inversa que permite a FRET e medições lRet ser extremamente sensíveis, mesmo a pequenas alterações da distância quando perto do R 0 do par de FRET. A capacidade para marcar especificamente locais desejados sobre as proteínas ou outras macromoléculas permite que se tire vantagem da presente sensibilidade para monitorizar as alterações conformacionais. Quando comparado com FRET, que utiliza moléculas de corante orgânicos convencionais, lRet oferece vantagens adicionais. Em lRet, em vez de usar um corante orgânico como o fluoróforo dador, um catião série dos lantanídeos, tipicamente Tb 3 + ou Eu3 +, é usado 1,4-6. Fluoróforos que u caemnder esta categoria, por exemplo, térbio quelato, também são muito versáteis porque podem ser utilizados com uma grande variedade de aceitadores de fluoróforos. Esta flexibilidade é possível porque o espectro de emissão de lantanídeos quelados conter vários picos de emissão cortantes, permitindo por uma única espécie de fluoróforo dador a ser utilizado com uma de uma grande variedade de aceitadores de fluoróforos. Assim, a emissão aceitante sensibilizados pode ser detectado sem qualquer medo de contaminar bleed-through a partir de doador de emissão 5. O experimentador selecciona o receptor específico com base na distância esperada entre os dois fluoróforos (Figura 1 e Tabela 1). Nestes fluoróforos lantanídeos quelados, o ião de metal é quelado por uma molécula que contém um grupo de antena que sensibiliza o lantanídeo normalmente mal-absorção de excitação, bem como um grupo funcional bioreactive para amarrar o ião de um grupo funcional específico da macromolécula 1, 5,6. Once animado, lantanídeos relaxar ao estado fundamental através da liberação de fótons com uma taxa de decaimento no intervalo de milissegundos. Porque a decadência não é nem um relaxamento singlet-a-camisola nem um relaxamento trio-to-atómico, a emissão de fótons não podem ser propriamente chamado de fluorescência ou fosforescência, mas é mais apropriadamente denominado luminescência 1. O tempo de decaimento de luminescência dos lantanídeos ajuda muito nas medições ao longo da vida. Lifetime medições podem então ser utilizados para determinar a eficiência por meio da seguinte relação: <img alt="Equação 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" /> Eq. 2 onde E é a eficiência de transferência, τ D é o tempo de vida do doador (lantanídeos quelados) quando não participam na transferência de energia, e τ DA é o tempo de vida do doador ao participar na transferência de energia com o aceitador. Com lRet, τ DA pode alassim ser medido como o tempo de vida da emissão aceitante sensibilizado porque a vida de térbio é muito maior do que um fluoróforo receptor orgânica. O receptor emite com o mesmo tempo de vida como incitar excitação (lantanídeos doador), e qualquer contribuição para a vida da própria vida de fluorescência intrínseca do receptor é relativamente insignificante. Ao medir a emissão sensibilizados ao invés de emissão de dador, que também eliminam a necessidade de assegurar a rotulagem em exactamente uma razão de 1: 1 de doador de aceitador. A proteína pode ser, em vez identificada simultaneamente com ambos aceitador e dador fluoróforos. A população heterogênea marcado resultará, mas proteínas marcadas duplo doadores não emite no comprimento de onda aceitante e proteínas marcadas duplo aceitador não vai ser animado. Além disso, a distância entre os fluoróforos deve ser a mesma, independentemente do local de cisteína um dado fluoróforo anexa, especialmente quando se utiliza os lantanídeos isotrópicas como um doador, de modo que o need para especificar um determinado local para receber tanto o dador ou aceitador é desnecessária. Intensidade pode ser afectada com uma população heterogénea, mas deve ainda ser mais do que suficiente para ser detectado. Ao planear experiências, a escolha dos fluoróforos deverá ser ditada pelo valor do par R 0, bem como o intervalo esperado distância a ser medida. O valor de R 0 é definido pela seguinte equação: <img alt="Equação 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" /> Eq. 3 onde, R 0 é o raio de Förster em Angstroms, κ 2 é o factor de orientação entre os dois corantes (geralmente assumido ser 2/3), φ D é o rendimento quântico do dador, J é a sobreposição espectral entre o dador integrante do espectro de emissão e espectro de absorção do aceitador em M - 1cm -1 nm 4, e n é o índice de refracção do meio 1. O nosso laboratório adicionou-se uma modificação da técnica de lRet convencional por introdução de um local de reconhecimento para proteases entre os locais dador e aceitador de etiqueta na proteína a ser sondada. Esta modificação permite a investigação em sistemas não-purificadas, tais como células de mamíferos inteiros 7. Esta técnica é particularmente útil quando se usa cisteína como locais de etiquetagem, uma vez que no processo de marcação com corantes de maleimida-conjugados que se ligam aos grupos sulfidrilo de cisteína, outras proteínas nas células que possuem cisteínas também são etiquetados. No entanto, através da inclusão de locais de clivagem de protease na protea de interesse e medir tempos de vida, antes e após a clivagem, o experimentador pode quantitativamente subtrair o sinal de fundo, depois de clivagem de protease a partir do sinal bruto. Esta subtracção isola o sinal específico proveniente da proteína de interesse (Figure 2). Usando a modificação acima descrita, lRet pode ser usado para medir as variações de distância entre o dador e o quelato térbio sonda aceitador numa proteína, e assim acompanhar as alterações de conformação no estado fisiológico perto da proteína sem a necessidade de purificação. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1.O espectros de absorção e emissão de térbio quelatado em preto, bem como um aceitador representativo, Alexa 488, em vermelho. Note os diversos picos de emissão e a gama de emissão afiado, estreita para cada pico de quelato térbio. Este padrão permite térbio para ser usado com uma variedade de fluoróforos aceitadores e facilita a medição da emissão de sensibilizado dentro daquelas gamas onde térbio mostra nenhuma emissão. Pico de emissão de 486 nm em Térbio sobrepõe bastante bem com o um<html> pico bsorption de Alexa 488, permitindo a transferência de energia de ressonância de ocorrer entre os dois fluoróforos. Um comprimento de onda de 515 nm é uma excelente escolha para detectar emissão sensibilizado para este par, pois é no vale entre os picos de emissão de térbio, e muito perto Alexa 488 do pico de emissão de 520 nm. Note-se que estar próximo do pico aceitador, embora desejável, não é necessário-565 nm, ainda é capaz de detectar a Alexa 488, sem emissão também a detecção de emissão de térbio. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> Aceitador Fluoróforo </td><td style="width:45px;"> R 0 (Å) </td><td style="width:183px;"> Comprimento de onda de emissão (nm) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> Atto 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Fluorescein </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trheight = &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Cy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> Tabela 1 uma lista de fluoróforos aceitadores geralmente usados ​​para lRet usando quelato térbio como dador 11. Os R 0 valores foram medidos quando o doador e receptor foram anexados ao agonista domínio de ligação solúvel dos receptores AMPA. É ideal para medir o valor de R 0 de novo para cada novo sistema a ser estudado. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Uma visão geral do método apresentado lRet. (A) do receptor de AMPA é uma proteína de membrana que sofre alterações conformacionais em cima de ligação ao ligando. O ligando-bi em forma de conchanding domínio está circulado em vermelho aqui. (B) O domínio de ligação ao ligando de AMPA não ligadas a proteína existe numa conformação aberta (esquerda). Quando ligada ao ligando de glutamato, a proteína é fechada em torno do seu ligando (direita). Ao colocar fluoróforos em locais de prova sobre a LBD, a natureza desta alteração conformacional pode ser vista como sendo a distância entre os fluoróforos, alterações que afectam, em seguida, a fluorescência vida. (C) Quando marcação das células inteiras, tanto a rotulagem de proteína de interesse, bem como as proteínas da membrana de fundo pode ocorrer (esquerda). Depois de clivagem de protease, o sinal lRet a partir da proteína de interesse irá desaparecer devido à libertação de um fragmento solúvel, deixando intacto o sinal de fundo (à direita). Este sinal de fundo pode ser subtraído a partir do sinal bruto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

Transferência de Energia de Ressonância de luminescência, ou lRet, é uma técnica poderosa usada para medir as distâncias entre dois locais em proteínas dentro da gama de distâncias de 10-100 Â. Ao medir as distâncias em várias condições de ligadura, alterações de conformação da proteína pode ser facilmente avaliada. Com lRet, um dos lantanídeos, térbio na maioria das vezes quelatados, é usado como o fluoróforo doador, proporcionando vantagens como uma vida mais apenas doadores de emissões, a flexibilidade de usar vários fluoróforos aceitador, ea oportunidade de detectar emissões aceitante sensibilizado como uma maneira fácil para medir a transferência de energia, sem o risco de também a detecção de sinal único doador. Aqui, nós descrevemos um método para usar em proteínas de membrana lRet expressas e ensaiadas na superfície de células de mamífero intactas. Nós introduzimos um site protease de clivagem entre o par fluoróforo lRet. Depois de obter o sinal de lRet inicial, a clivagem no local que remove o sinal lRet específica da proteína deinteresse que nos permite quantitativamente subtrair o sinal de fundo que permanece após a clivagem. Este método permite medições mais fisiologicamente relevante para ser feito sem a necessidade de purificação da proteína.

Uma medição lRet sucesso com um doador de lantanídeos devem ter um só doador vida no intervalo de tempo em milisegundos. O tempo de vida de emissão lRet sensibilizado para a proteína marcada com o dador e o aceitador será notavelmente mais curta, com um tempo de vida na gama de microsegundos após subtracção do fundo da Figura 3. Protease clivagem resulta num aumento do tempo de vida que deve tornar-se estável ao longo do tempo ( ou seja, já não mudar), demonstrando que a clivagem d...

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Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Descrevemos aqui um método melhorado de transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) onde é considerado um local de clivagem da protease entre os locais fluoróforo doador e receptor. Esta modificação permite a obtenção de sinais lRet específicas decorrentes de proteínas de membrana de interesse, permitindo o estudo de proteínas de membrana, sem purificação de proteínas.

Luminescência Ressonância transferência de energia para estudar mudanças conformacionais na membrana proteínas expressas em células de mamíferos

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

luminescence-resonance-energy-transfer-to-study-conformational

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K visualizações.  University of Texas Health Science Center at Houston.  Descrevemos aqui um método melhorado de transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) onde é considerado um local de clivagem da protease entre os locais fluoróforo doador e receptor. Esta modificação permite a obtenção de sinais lRet específicas decorrentes de proteínas de membrana de interesse, permitindo o estudo de proteínas de membrana, sem purificação de proteínas. 

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

Visualizando Proteínas e Complexos Macromoleculares por Negative EM Stain: Preparação de Grid para Aquisição de Imagem

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Bioengenharia

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

Um sistema experimental para estudar Mecanotransdução em células do pulmão fetal

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Um Orbital agitando a cultura de células de mamíferos em vasos em forma do produzir agregados uniformes

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...