O protocolo fornece um procedimento simples para tornar os experimentos de FRET por meio de emissões sensibilizadas mais reprodutíveis e comparáveis. A principal vantagem do FRET são as medições em tempo real para que processos dinâmicos possam ser abordados. Para ajuste a laser usando um fotomultiplier de transmissão, coloque o slide de oito poços contendo os protoplastos transfectados sob o microscópio.
Depois de selecionar um poço vazio, escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma, diminua a intensidade do laser ao mínimo e ajuste o ganho do detector para ruído de fundo detectável. Em seguida, aumente a intensidade do laser em etapas de 0,5% ao registrar o sinal correspondente. Para ajuste a laser usando o modo reflexivo, selecione um poço vazio e aplique um filtro de reflexão.
Ligue o modo de reflexão e certifique-se de que o comprimento de onda do detector cubra o comprimento de onda do laser. Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma, diminua a intensidade do laser ao mínimo e ajuste o ganho do detector para ruído de fundo detectável. Em seguida, mova o objetivo para a posição mais baixa antes de movê-lo de volta até que o reflexo do deslizamento de cobertura seja visível, em seguida, aumente a intensidade do laser em etapas de 0,5% durante o registro do sinal correspondente.
Para avaliação de dados, tabular e classificar os dados por intensidades de sinal, em seguida, traçar as intensidades do sinal contra a potência laser relativa e escolher as intensidades de laser resultando em uma intensidade de sinal semelhante. Para o ajuste dos fotomultipliers, selecione um poço vazio e aplique um filtro de reflexão, mude para o modo de reflexão e certifique-se de que o comprimento de onda do detector cubra o comprimento de onda do laser. Escolha o modo de varredura de linha e a visualização do histograma, diminua o ganho do detector para metade do máximo e ajuste a intensidade do laser para ruído de fundo detectável.
Em seguida, mova o objetivo para a posição mais baixa antes de movê-lo de volta até que o reflexo do deslizamento de cobertura seja visível, em seguida, aumente o ganho do detector em passos de 50 a 100 volts e regise o sinal correspondente. Para avaliação de dados, plote a intensidade contra o ganho do detector para cada detector e escolha os ganhos individuais do detector para obter sensibilidade semelhante. Para aquisição de imagens, escolha os filtros ou espelhosdicróicos apropriados e use o mesmo espelhodicróico para todos os canais para habilitar a varredura de linha por linha, em seguida, selecione um objetivo de imersão de água para a imagem de células vivas e escolha 12 ou 16 bits de varredura com velocidade de varredura moderada.
Em seguida, defina a faixa de detecção de preferência de 470 a 510 nanômetros para detecção de doadores e de 530 a 600 nanômetros para detecção de aceitadores no caso do par DESURRE de proteína fluorescente de ciano ou ECFP e proteína fluorescente amarela aprimorada ou EYFP. Depois de aplicar as configurações do detector e do laser, como demonstrado anteriormente, revise a intensidade do laser com base na tabela de potência laser obtida, se necessário. Certifique-se de que a relação sinal-ruído cubra toda a gama dinâmica dos detectores.
Após ajuste fino com o diâmetro do orifício enquanto mantém as intensidades do laser e o detector ganha constante, realize as medidas do FRET tirando imagens de pelo menos 20 células. Para determinar as correções do crosstalk, realize as medições de FRET com células expressando apenas o fluoróforo doador e aqueles que expressam apenas o fluorophore aceitador. Para calibração das medições, realize medições de FRET com células expressando a fusão aceitadora do doador.
Para avaliação de dados, obtenha perfis de linha das células garantindo que cada perfil não contenha mais do que uma célula. Salve os perfis como arquivos de texto. Em seguida, usando a opção de importação de arquivos de texto na seção de dados, importe os arquivos de texto em uma planilha.
Em seguida, leia os valores máximos aplicando a função máxima, em seguida, liste os valores obtidos em uma tabela com uma coluna cada para ID de emissão de doadores, Emissão DE FRET IF, emissão de aceitador IA, e pelo menos quatro conjuntos de dados, apenas doadores, apenas aceitador, fusão e medição de doadores- aceitador. O ajuste a laser revelou um aumento linear da emissão com aumento da intensidade do laser. Como mostrado por uma inclinação mais íngreme, a emissão da linha de 514 nanômetros foi muito maior do que a emissão da linha de 458 nanômetros.
A variação dos ganhos do detector com energia laser constante revelou um comportamento exponencial para ambos os detectores analisados. A discrepância e o sangramento espectral do doador e do aceitador analisados com proteínas purificadas recombinantes e que analisadas com células expressando essas proteínas demonstram que é impossível omitir a determinação do sangramento espectral em células vivas provavelmente causadas por pigmentos celulares. A eficiência do FRET entre as subunidades atpa vacuolar rotuladas, VHA AECFP e VHA AEYFP diminuiu com o aumento da intensidade do sinal.
Em contraste, a interação entre VHA E1 ECFP e VHA CEYFP foi independente da intensidade do sinal. A escolha de componentes ópticos adequados é crucial para a detecção do doador e do aceitador. Este protocolo também pode ser aplicado para sensores ratiométricos em células vivas para aumentar a reprodutibilidade nesses experimentos.
