Este protocolo usa irradiação de luz violeta visível para induzir fotólise mononucleotídica de flavina. Isso produz uma grande quantidade de radicais livres, que inibem bactérias patogênicas, como Staphylococcus aureus e E.coli. Testamos o mononucleotídeo de flavina como um fotossensibilizador apropriado.
Neste protocolo, usamos luz violeta visível, que é segura e não requer equipamentos caros. Este método pode ser usado para a terapia de pele lesada ou tecidos subcutâneos infectados, inserindo uma fibra óptica para iluminação. Também pode ser aplicado à prática de saneamento na indústria de alimentos.
Demonstrando o procedimento estará Tang-Yu Chen, um estudante de pós-graduação do meu laboratório Para começar, montar seis diodos emissores de luz de 12 volts cada um no interior de um copo plástico opaco. Pegue um tubo de ensaio de vidro com um diâmetro de 13 milímetros e uma altura de 100 milímetros e adicione os reagentes ao tubo. Prenda os tubos na parte superior do copo e coloque esta configuração a uma temperatura constante de 25 três graus Celsius.
Monitorar e registrar a temperatura das unidades de teste ao longo das reações fotolíticas por um termômetro infravermelho. Em seguida, prepare uma solução de FMN 0,1 milimolar em tampão fosfato de potássio 100 milimolares em pH 7,8. Exponha três mililitros de amostras de FMN cada uma à luz azul, verde, vermelha ou violeta por cinco minutos.
Em paralelo, mantenha três mililitros de solução de FMN no escuro como controle. Coloque a amostra em um espectrofotômetro UV-visível e registre a absorvância de amostras irradiadas na faixa de 250 a 750 nanômetros. Para se preparar para a detecção de radicais superóxidos, primeiro adicione 109,3 miligramas de L-metionina a 73,3 mililitros de tampão fosfato de 100 milimolares a pH 7,8.
Na solução, adicione 10 miligramas de pó de NBT e 1,5 mililitros de FMN 0,117 milimolar. Exponha um mililitro da solução de reação à luz LED azul ou violeta por um a cinco minutos. Registre a absorvância de 516 nanômetros para detectar formazan, que é produzida pela reação fotoquímica do NBT.
Inocular uma colônia de Staphylococcus aureus em 10 mililitros de caldo de lisogenia em um tubo de ensaio com tampa de parafuso de 15 mililitros. Cultive a cultura a 37 graus Celsius por 16 horas em um shaker. Transfira 0,5 mililitros da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Diluir a cultura para uma densidade óptica de 0,5 a 600 nanômetros adicionando água esterilizada. Em seguida, transfira 0,5 mililitros da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar a 14.000 G durante 10 minutos e decantar o sobrenadante.
Adicione um mililitro de solução tamponada de FMN ao pellet celular e ao vórtice. Para controle irradiado, adicione um mililitro de tampão fosfato. Transfira um mililitro de solução de células bacterianas contendo 30 micromolares FMN e tampão fosfato para tubos de vidro.
Coloque-os para uma radiação sob luz violeta a 10 watts por metro quadrado por 30 minutos. Em seguida, transfira um mililitro de solução de células bacterianas contendo FMN 30-60-e 120-micromolar e tampão fosfato em tubos de vidro. Irradiar com luz azul por 120 minutos a 20 watts por metro quadrado.
Além disso, irradie um tubo contendo um mililitro de FMN 120-micromolar por 60 minutos. Após irradiação, adicionar 0,2 mililitros da solução de reação a uma placa de ágar luria. Espalhe a solução usando uma haste de vidro em forma de L e incube durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, calcule a contagem de placas viáveis e a taxa de inativação de Staphylococcus aureus. Prepare as amostras de Staphylococcus aureus conforme descrito anteriormente para obter um pellet celular. Para 75 mililitros de tampão fosfato adicionar 0,1093 gramas de L-metionina, 0,1 grama de NBT, e 25 mililitros de solução de FMN.
Adicionar um mililitro de cada solução reagente com concentrações variáveis de FMN aos pellets celulares e ao vórtice. Irradiar as soluções sob luz violeta a 10 watts por metro quadrado durante 10 minutos. Centrifugar a mistura a 14 000 G durante 10 minutos e decantar o sobrenadante.
Ressuscite o pellet em um mililitro de dimetilsulfóxido para extrair o NBT reduzido. Registre a absorbância a 560 nanômetros. A irradiação de FMN com luz verde e vermelha não mostrou efeito sobre os picos em 372 e 444 nanômetros em comparação com o controle escuro, enquanto a redução na absorvância de FMN em 444 nanômetros foi observada sob luz azul e violeta, indicando aumento da fotólise.
A detecção de radicais superóxidos formados durante a fotólise FMN sob luz azul ou violeta foi feita usando redução de NBT. O efeito fotoquímico da FMN foi dependente do tempo de irradiação. A fotólise FMN usando irradiação de luz azul ou violeta resultou em inativação significativa de Staphylococcus aureus.
A inativação dose-dependente foi observada para irradiação de luz azul, com 97% de inativação alcançada para NMF de 120 micromolares. Sob luz violeta, uma taxa de inativação de 96% foi alcançada para o staphylococcus aureus, com FMN 30-micromolar mostrando maior eficácia para a inativação bacteriana. A redução do NBT mostrou que o efeito fotolítico da FMN sob luz violeta em Staphylococcus aureus foi proporcional à concentração de FMN.
Em condições não tratadas, uma menor abundância de radicais superóxidos foi indicada por baixa absorvância a 560 nanômetros, enquanto maiores valores de absorvância no tratamento com FMN mostraram produção abundante de radicais superóxidos, resultando em aumento do efeito fotoquímico. É fundamental ter uma boa fonte de luz LED. A largura espectral do regime de luz violeta deve ser estreita para evitar qualquer sobreposição com a absorção UV, uma vez que a radiação UV pode ser perigosa.
Após o procedimento, outros compostos químicos, como tetraciclina, doxiciclina, catequina e podem ser testados para fotólise semelhante à FMN.
