A espectroscopia de ressonância plasmônica de superfície foi estabelecida para a determinação do ligante proteico de forma de rendimento médio. Diferentes afinidades para variantes de sítios de ligação da mesma molécula são apresentadas, nomeadamente para a ligação de ferro a oligossacarídeos de alta qualidade em vírus. A SPR é uma técnica livre de rótulos para estudar a ligação macromolecular em tempo real de receptores imobilizados de superfície.
As interações multissítio são reconhecidas na análise cinética pela vinculação competitiva independentemente do tamanho das áreas específicas em pesquisa que utilizam a RPS são o desenvolvimento de fármacos para busca de inibidores ou caracterização de anticorpos. Constantes cinéticas e afinidades são calculadas diretamente a partir da resposta do sensor. Para começar, transfira 100 microlitros da solução em placas de ágar LB e espalhe-a suavemente usando um espalhador de células estéreis.
Inicie uma série de reações de amostra usando múltiplas concentrações de molde de DNA de fita dupla variando de cinco a 50 nanogramas, mantendo a concentração do primer constante. Em seguida, adicione a enzima de restrição DpnI abaixo da sobreposição de óleo mineral e incube imediatamente a 37 graus Celsius por uma hora para digerir o DNA de fita dupla superenrolado parental. Para descongelar as Células Supercompetentes XL1-Blue, aliquote as células a um tubo inferior pré-refrigerado, pequeno e redondo.
Em seguida, transfira um microlitro do DNA de fita simples tratado com DpnI de cada reação de controle e amostra para alíquotas separadas das células supercompetentes que sintetizam a fita complementar. Depois de girar as reações de transformação cuidadosamente para misturar, incube as reações no gelo por 30 minutos. Aplique pulso de calor nas reações de transformação a 42 graus Celsius por 45 segundos e, em seguida, coloque as reações no gelo por dois minutos.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros de NZY+Caldo e incube as reações de transformação a 37 graus Celsius com agitação a 225 a 250 RPM por uma hora. Posteriormente, pratique o volume correto de cada reação de transformação em placas de ágar ampicilina LB, conforme demonstrado anteriormente. Para uma cultura de sementes, inocular uma pequena quantidade de ampicilina contendo meios LB com uma única colônia da placa transformada.
Usando a cultura noturna, inocular a cultura de expressão com aditivos incluindo 10 milimolares de cloreto de magnésio, 10 milimolares de sulfato de magnésio e 20 milimolares de glicose, diluindo a cultura de sementes para um por 100. Em seguida, cultive células com agitação vigorosa a 37 graus Celsius a um absorvente de 600 nanômetros entre 0,4 a 0,6 antes de resfriar as células a 20 graus Celsius e induzir com um IPTG milimolar e crescer durante a noite. Em seguida, colha as células por centrifugação a 4.000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante.
Após a ressuspensão do pellet celular em tampão salino tamponada com fosfato, refúgio recente a 4.000 g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante com uma pipeta. Em seguida, ressuspeite o pellet restante em 10 mililitros de tampão de lise e incube a suspensão por uma hora a 37 graus Celsius.
Em seguida, separe as fracções solúveis e insolúveis por centrifugação a 4 000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Além disso, use HIS-Select Ni2+Affinity Gel em tubos de 14 mililitros para ligar e ressuspender sua cianovirina-N expressa recombinantemente em soluções tampão com imidazol milimolar e imidazol 250 milimolares, respectivamente. Incubar em lote durante pelo menos 30 minutos entre estes passos.
Adição do tampão de eluição contendo 250 milimolares de imidazol à proteína elutiva. Transferir as soluções proteicas para tubos de centrifugação com um filtro de corte Dalton de 10 quilos e concentrá-las centrifugando durante 10 minutos a 4, 500 g e quatro graus Celsius. Adicionar o tampão de funcionamento SPR a um factor de diluição de um a 10 e centrifugar quatro vezes até ao volume inicial durante 10 minutos a 4, 500 g e quatro graus Celsius.
Posteriormente, determine a concentração de proteína a 280 nanômetros usando um espectrofotômetro UV-Visible NanoDrop com base no coeficiente de extinção calculado para a proteína principal CVN2L0 mostrando um tamanho de 23, 474 Dalton. Para o sistema SPR de canal duplo, use HBSCP plus como tampão de funcionamento, ácido clorídrico de glicina 10 milimolares de pH 1,5 a 1,6 como tampão de regeneração e ligue o desgaseificador de instrumentos, o amostrador automático e a bomba. Em seguida, lave todo o sistema com água destilada duas vezes por uma hora.
Em seguida, solte o óleo de imersão no detector e monte um chip sensor de vidro revestido com um filme fino de ouro. E no lado superior, funcionalizado com hidrogel carboximetil dextran diretamente no detector abaixo da célula de fluxo de três portas. Em seguida, fixe a configuração puxando o manuseamento para baixo.
Para imobilizar os ligantes proteicos para chips sensores, abra uma tabela de execução clicando em Formulário na barra de menus e execute o editor de tabela no software de link automático SPP integrado. Em seguida, escolha e clique em Imobilização Básica na lista de tabelas de execução disponíveis e siga as etapas do procedimento experimental na tela do computador. Em seguida, clique em Sample Set Editor na seção de formulário para preencher a lista de reagentes para dois racks colocados no amostrador automático para análise posterior.
Clique em Autosampler Direct Control como uma ferramenta na barra de menus para trazer os racks para frente ou para casa e escolha quatro graus Celsius como a temperatura de operação. Ligue a bomba para infundir água destilada duplamente clicando em ferramentas e controle direto da bomba. E registre os dados clicando em SPR Instrument Direct Control.
E cada vez, comece na janela recém-exibida. Depois de adicionar os reagentes de acoplamento em frascos para injetáveis de 300 microlitros, coloque-os nos racks do amostrador automático e inicie a tabela de execução clicando em Executar. Para a interação proteína-proteína simples, depois de reabastecer a bomba a 25.000 microlitros por minuto, execute o ajuste da linha de base por 30 segundos.
Permitir o ajuste de linha de base subsequente com água destilada dupla por 1,5 minutos antes de extinguir a superfície do chip ativado com um cloridrato molar de etanolamina, pH 8,5. Em seguida, mude os tubos do amostrador de líquido para o desgaseificador de água destilada dupla para a garrafa com HBS-EP + Clique no formulário, role para baixo e mude para Pós-processamento clicando neste modo de operação. Em seguida, clique em Adicionar para selecionar curvas de ligação geradas ao longo do tempo na plataforma de dados para cada célula de fluxo e exporte a sobreposição como um arquivo de depuração.
Em seguida, clique em Arquivo para abrir as opções de salvamento de arquivos e obter curvas de resposta alinhando as curvas esquerda e direita e subtraindo os sinais do segundo canal de referência daqueles do canal do ligante. Injeções únicas de CVN2L0 e variância V2 e V5 foram testadas pela primeira vez para ligação ao chip do sensor acoplado à hemaglutinina para estimar as capacidades de ligação usando o amostrador automático e o editor de mesa de execução. Injeções repetidas foram automatizadas em várias concentrações na faixa nanomolar e micromolar no sistema ao longo do tempo, demonstrando que nenhuma saturação na superfície do chip nem ligação de equilíbrio foi alcançada.
A concentração versus resposta foi plotada para a ligação do tipo selvagem da DCV à DCR, assumindo o direcionamento específico de carboidratos possivelmente conservados na subunidade RBD S1 com afinidade mais fraca, com uma taxa de dissociação constante de 260 micromoles. O mesmo gráfico de afinidade para a ligação de CVN2L0-V4 ao DM torna-se mais analisável devido à substituição de ligações dissulfeto que interferem na ligação de alta afinidade a pequenos peptídeos glicosilados e produzem uma resposta maior do que o valor máximo de resposta. A ligação do tipo selvagem da DCV ao RBD no SARS-CoV-2 mostra ligação à proteína S e à RBD com uma constante de raiva de dissociação de 18,6 micromoles e 260 micromoles, respectivamente.
Embora a resposta do SPR para as concentrações de analitos resulte em unidades de resposta elevadas e sensorgramas SPR típicos para ligação do tipo selvagem CVN e E41A. No entanto, o mutante é instável quando diluído. A biossensoriamento SPR está abordando a ligação de alta afinidade e baixa afinidade de proteínas purificadas e suas variantes a ligantes.
No nosso caso, glicoproteínas explorando a leitura óptica e o sistema de fluxo de canal duplo na superfície do chip do sensor. O ensaio imunoenzimático é um método imunológico alternativo que reconhece epítopos proteicos, mas também fornece dados sobre a concentração de peptídeos e pequenas moléculas fora de matrizes complexas. O teste de proteínas expressas recombinantemente por ensaios de ligação SPR incorporou biossensoriamento de alterações confirmacionais que é útil para a verificação e previsão da estabilidade da proteína pelo lado computacional da proteína.
