Os exossomos podem reagir a vesículas secretadas por uma célula entre 14 e 200 nanômetros de tamanho, e se separar da carga e comunicação intracelular, que chega ao menor subgrupo de vesículas extracelulares. Exossomos que são formados como resultado da diferenciação do endossomo, originam-se da membrana celular. As células-tronco podem ser isoladas de diferentes fontes, como medula óssea ou tecido adiposo.
mas as células-tronco secas do tecido adulto têm maior potencial imunogênico Cons surgindo o tamanho dos exossomos, é dito que fez um papel importante na doença do sistema nervoso central porque pode passar através da barreira hemato-encefálica. Para começar, lave as células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton com cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicionar cinco mililitros de solução de tripsina EDTA antes de colocar o balão numa incubadora.
Após a incubação, coletar as células e centrifugar a 1.500 G por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e adicione um mililitro de DMEM-F12 contendo 10% FBS ao tubo. Lavar células cultivadas com PBS.
Após a lavagem, adicionar meio DMEM-F12 livre de soro às células e colocá-lo na incubadora. Para isolar os exossomos, coletar o meio livre de soro e centrifugar a 300 G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Transfira o sobrenadante para outro tubo e processe-o por centrifugação seriada em velocidades mais altas.
Após a centrifugação final, remova lentamente o sobrenadante e dissolva o pellet em PBS de um mililitro. Misture por vórtice e prossiga com a ultracentrifugação a 110.000 G por 70 minutos a quatro graus Celsius. Adicionar três mililitros de PBS à suspensão do exossomo coletada anteriormente por ultracentrifugação e esterilizar a suspensão diluída por filtração usando um filtro de 0,22 mícron.
Em seguida, transfira 500 microlitros da suspensão esterilizada do exossomo para outro tubo. Em seguida, sequencialmente, adicione 500 microlitros de 0,5 miligramas por mililitro de solução de dopamina e saponina na suspensão esterilizada. Após a incubação ultracentrifugar a suspensão.
A amostra pode ser usada para análise de NTA e DLS para caracterizar exossomos carregados de dopamina ou armazenada a menos 20 graus Celsius até uso posterior. Na análise NTA, o tamanho médio dos exossomos derivados da geleia de Wharton foi determinado como sendo 98 nanômetros e os exossomos carregados com dopamina como sendo 110 nanômetros. Os números de nanopartículas revelados pelas análises de NTA e DLS foram consistentes entre si.
O potencial zeta dos exossomos derivados da geleia de Wharton foi medido como menos 15,7 e os exossomos carregados de dopamina como menos 17,6 milivolts. A análise por HPLC dos exossomos carregados de dopamina detectou o pico de dopamina aos 6,45 minutos. O perfil de liberação cumulativa da droga revelou que 74,8% da dopamina encapsulada foi liberada dos exossomos nas primeiras oito horas.
A citotoxicidade dos exossomos dopamina carregados e livres em fibroblastos foi investigada. Embora os exossomos carregados de dopamina não tenham demonstrado efeitos citotóxicos, a saponina diminuiu a viabilidade dos fibroblastos. O ensaio de MTT mostrou aumento da viabilidade celular quando os fibroblastos foram tratados com os exossomos carregados de dopamina.
A significância estatística dos resultados foi avaliada pela realização de anova one-way. Adicionalmente, os efeitos citotóxicos de diferentes concentrações de exossomos livres foram investigados sobre os fibroblastos. A viabilidade dos fibroblastos foi maior com os exossomos livres na concentração de 25 microlitros por mililitro.
É realmente importante para o sistema nervoso central é o tamanho do paciente, o papel desempenhado nos processos como plasticidade, resposta neuro, comunicação lado a lado, e neurogênese no cérebro. Além disso, graças à superfície dos exossomos, diz, foi observado que eles podem interagir com a droga da célula alvo e a atividade entregue durante a droga é uma conclusão. Pela primeira vez no estudo, desenvolvemos uma nova formulação de droga encapsulando dopamina em exossomos derivados de células-tronco.
Ele propôs que essa formulação será tão promissora para o tratamento da doença de Parkinson.
