Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional do Coração e Pulmão (R01 HL086582) e do Fundo de Ciência Stem Cell New York (NYSTEM, Contrato # &#160; C024316) para STA e DDS ilustrações utilizadas vídeo JoVE foram preenchidos por John Nyquist; Illustrator Medicina da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo.

NOTA: Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo. Preparação 1. Pré-cirúrgica <ol><li> Use ovelhas (Dorset cruz, fêmea, cerca de 1-3 anos de idade com um peso de 40-60 kg) para o seguinte estudo. Administrar ciclosporina A (200 mg / dia), aspirina (975 mg / dia), e coumadina (20-30 mg / dia) por via oral, começando 3 dias antes da cirurgia e continuar para a duração de todos os estudos. </li><li> Garantir a ovelha jejuou 12 horas antes da cirurgia (alimentação normal = 1,8 kg de feno e 0,4 kg de grãos). </li><li> Esterilizar todos os materiais cirúrgicos usando um autoclave a vapor a 121 ° C e 15 psi durante 30 min. </li><li> Coloque os seguintes itens em uma hr paraformaldeído secador 48 antes da cirurgia: 4 mm sondas de fluxo Doppler, um milímetro cristais ultra-sônicos, cateteres arteriais residente, extensão de tubos e 42 &quot;Tygon Tubing. NOTA: A tabela de equipamentos médicos relevantes necessárias àcirurgia e para a esterilização está listado na Tabela 1. Pré-colocação de instrumentação dentro da tubagem em Tygon neste passo vai ajudar a poupar tempo durante a cirurgia. <ol><li> Escreva em cada extremidade das sondas, cateteres e cristais como esquerda e direita, se for o caso. </li></ol></li></ol> 2. Operação Cirúrgica <ol><li> Ovelhas para induzir anestesia com diazepam (0,5 mg / kg) e cetamina (4 mg / kg) por via intravenosa (IV). Alternativamente, usar Telazol (4 mg / kg) IV. <ol><li> Realizar intubação orotraqueal com um diâmetro 8,5-10,0 mm interno algemado tubo endotraqueal 7. </li><li> Administrar anestesia por inalação através de um circuito de reciclagem do ar com um ventilador de volume corrente (7-10 ml / kg) ou um ventilador de pressão regulada (15-20 cm de H 2 O). Use um vaporizador de precisão para administrar isoflurano ou sevoflurano em uma quantidade adequada (3% -4% inicialmente) para chegar a uma média a profunda fase anestésico cirúrgico. A concentração mínima para alveolarovinos é de 1,4% ou 1,9%, respectivamente 8. </li><li> Avaliar a profundidade da anestesia por meio da observação da resposta motora aos estímulos, reflexo palpebral, a posição dos olhos, e freqüência cardíaca. Monitor de saturação de oxigênio no sangue (95% -100%) pela oximetria de pulso, concentração de CO 2 (45-55 mmHg) em gases expiratórios usando capnografia e manter a temperatura corporal durante o procedimento (38,5-39,5 ° C), utilizando um auto regulado manta térmica. </li></ol></li><li> Raspar lã de todo o pescoço do ovino, e sobre uma veia cefálica, utilizando uma lâmina de # 40 na tosquiar padrão. Prepare a pele de ambos os sites para cirurgia, utilizando 70% de álcool isopropílico e 7,5% betadine matagal gaze saturada. Comece com álcool gaze para facilitar a remoção da oleosidade da pele. Alternar entre gaze betadine e álcool gaze três vezes. </li><li> Coloque ovelha para a mesa de operação em decúbito dorsal no topo de um cobertor de aquecimento. Passe uma sonda orogástrica de tamanho médio para permitir a expulsão passiva do conteúdo do estômago. Estender apescoço e de ovelha usar amortecimento de apoio conforme necessário para manter a colocação. <ol><li> Realize uma esfoliação asséptica final usando 7,5% betadine gaze embebida e deixe descansar por 5 minutos antes da cirurgia. </li></ol></li><li> Administrar fluidos IV (solução de lactato de Ringer ou soro fisiológico 0,9%) a 10 ml / kg / h através de um angiocath colocado na veia cefálica. Administrar antibióticos intra-operatórios e analgesia: penicilina G procaína 6.600 U / kg por via intramuscular (IM), gentamicina 1,6 mg / kg IM, e buprenorfina 0,005-,01 mg IV ou IM. </li><li> Faça uma incisão ~ 12 cm do comprimento sobre o pescoço ventral com bisturi electro. Isolar as artérias carótidas direita e esquerda (~ 6 cm) por remoção do tecido conjuntivo, utilizando uma técnica de dissecção romba. Empate fora e cauterizar micro-vasos de ramificação das artérias carótidas para minimizar o sangramento. </li><li> Manter a esterilidade, utilizando (a não-estéril) enfermeira cirúrgica para ajudar na construção de galerias toda a fiação e tubulação (sonda de fluxo, fios de cristal ultra-sônicose tubo do cateter) na camada subcutânea da pele. Use a trocar embotada, que sai através da incisão preparado cirurgicamente no pescoço dorsolateral. <ol><li> Alcançar sob o campo estéril e virar a cabeça da ovelha de modo a que a parte lateral do pescoço pode ser visualizada sob a cortina. </li><li> Utilize uma pinça hemostática curva 8 cm a túnel através do espaço subcutâneo entre a incisão na linha média ventral do pescoço e a parte lateral do pescoço. Abra e feche a pinça hemostática para dissecar sem rodeios um espaço para a tubulação de cerca de 1,5 cm de largura. As dicas da pinça hemostática deve residir no meio do caminho entre a cabeça e os ombros, aproximadamente 10 cm caudal para o ouvido direito ou esquerdo. Vire a pinça hemostática para que as pontas estão apontando na direção da pele superficial. </li><li> Alcance sob a cortina estéril e fazer um 1,5 centímetros incisão através da pele, sobre as pontas da pinça hemostática com um estéril # 11 da lâmina. Visualize as pontas da pinça hemostática para confirmar a saída clara através da pele. </li><li> Passe o tubo Tygon contendo umfiação ll e tubos através do túnel subcutâneo. Mantenha os fios e tubos acima do campo estéril. </li><li> Alcance sob a cortina para remover o tubo exterior Tygon do pescoço, expondo a fiação da implantado, uma vez que deixa o pescoço do ovino. Puxe linhas individuais de forma a minimizar qualquer folga no espaço subcutâneo. Deixe uma distância suficiente para unir corretamente a instrumentação para a artéria. </li></ol></li><li> Coloque 4 milímetros sondas de fluxo Doppler em ambas as artérias carótidas e atingir uma leitura inicial (Figura 1). Administrar 100 U / kg de heparina IV 30 min antes do pinçamento da artéria. </li><li> Continue a administração de heparina a 100 U / kg / h até ao final da cirurgia. Prenda a artéria carótida usando non-esmagamento pinças vasculares e extirpar uma porção (cerca de 4 cm de comprimento). A taxa de fluxo da carótida contralateral aumente em 50% -100%, para manter o fluxo sanguíneo para o cérebro. Nota: É possível limitar trecho longitudinal pelo recuo do vaso nativo, removendosegmentos mais curtos do que está sendo substituído e / ou alongamento da artéria nativa com vascular grampos para encurtar lacuna até anastomotic procedimento completo é concluído. Isso vai ajudar a limitar a tensão na sutura exploração individual, tendo o enxerto implantado. </li><li> Suturar a TEV no local usando pontos isolados simples com 7-0 prolina ethalloy dupla sutura de monofilamento armado. Se necessário, aplicar relaxantes musculares lisas vasculares, tais como a papaverina (15 mg / ml) ou nicardipina (1,25 mg / ml) por via tópica à vasculatura nativa, a fim de impedir a vasoconstrição, que iria dificultar a sutura da anastomose. NOTA: Comece colocando suturas com espaçamento de cerca de 1 mm. Isso pode variar muito de caso para caso. A composição e espessura TEV irá afectar a distância efectiva entre as suturas. À medida que a espessura do tecido nativo ou TEV diminui, pode ser necessário para colocar as suturas mais juntos. <ol><li> Primeiro âncora de quatro pontos de TEV à artéria nativa, colocando dois s opostastitches em ambas extremidades proximal e distal (Figura 2 -di). Segure cada âncora ensinou usando hemostats. NOTA: descrições proximal e distal são em referência a direção do fluxo de sangue por todo o papel. </li><li> Adicionar mais 5-6 suturas sobre o lado superficial de ambas as extremidades proximal e distal para iniciar a anastomose. (Figura 2-Pr). Simultaneamente rodar o vascular grampos 180 graus. </li><li> Restabelece-se a tensão sobre as suturas de ancoragem. Adicionar adicional (5 a 6) para suturas interrompidas extremidades proximal e distal do lado girado de TEV. </li></ol></li><li> Uma vez que o TEV está devidamente suturado no lugar, gire-a de volta para a posição original e retire a vascular grampos um de cada vez, braçadeira distal primeiro. Ligeiro sangramento nos locais de anastomose é comum. Isso pode resolver naturalmente após vários minutos de liberação grampo e reclamping ou exigir a colocação de pontos adicionais. Coloque a sonda de fluxo Doppler (Figura 3-Fl) De volta em proximal da artéria nativa ao fluxo de sangue que entra no TEV e vazão monitor. NOTA: O prazo as taxas de fluxo da carótida esquerda e direita para equilibrar após aproximadamente 15 min. Se a taxa de fluxo na artéria carótida com TEV firmemente implantada gotas, é possível que a TEV é coagulação. Outras alterações possíveis em relação ao fluxo pode ser atribuído à constrição da artéria nativo proximal ou distal ao TEV. Se isto ocorrer, o uso de relaxante do músculo liso vascular adicional pode ser aplicada, e o vaso nativo deve retornar a um tónus basal após 30-60 min após o encerramento do tecido sobre o sítio do enxerto. <ol><li> Se desejar, extirpar a artéria carótida contralateral e sutura-lo de volta no lugar, como um controle &quot;Sham&quot;. Isto é mais clinicamente relevante do que deixar a artéria carótida direita e sozinho só prender a sonda de fluxo, os cristais ultra-sons, e o cateter. Se um controle sham é querido, faça isso antes de prosseguir para a etapa 2.11. </li></ol></li><li> Suturar um milímetro cristais ultra-sônicas (Figura 3 CR1 CR2) para lados opostos do TEV usando 7-0 prolina. Fio de sutura através da cabeça de cristal ultra-som e pontos apenas na camada superficial da TEV. </li><li> Cateterize artéria utilizando uma versão modificada 18 G cateter com uma abertura Teflon tecido (Figura 3- Ca &amp; Figura 4A). Coloque a distal do cateter para o TEV em tecido arterial nativo. <ol><li> Sutura do bolso para a parede arterial com 5/0 Ethibond para controlar qualquer hemorragia. Use ciclohexanona a aderir o tubo de orifício micrométrico para o cateter que foi lavada com solução salina. Use a tubulação, como uma linha de extensão. </li><li> Usar um adaptador Luer 20 L curtas com um plug Injection Surflo para vedar a extremidade do tubo exteriorizado (Figura 4B). Para manter a permeabilidade do cateter, se obter o volume de escorvamento da linha e lavá-la com 10 ml de solução salina e, em seguida, 5.000 U / ml de heparina de sódio injecção a cada 2-3 dias. </li></ol></li><li> Grave a distância entre a sonda de fluxo ultra-sons e os cristais, bem como a distância entre a sonda de fluxo e o cateter. Esta velocidade de onda de pulso permitirá a ser calculado em conjunto com o software. Se tais cálculos não são necessários, não implante de um cateter. </li><li> Obter uma leitura intra-operatória, se desejar para garantir todo o hardware implantado é funcional (ver secção 3). </li><li> Fixe linhas implantadas e fios para musculatura próxima usando 2/0 de seda e uma agulha cônica (Figura 3). <ol><li> Posicione o fluxo vascular sonda fio paralelo ao navio, com o caudal da sonda e o fio que se estende no sentido cranial, e, em seguida, fazendo um &quot;U-Turn&quot; em direção a musculatura lateral. Fixar o cabo de musculatura adjacente, utilizando seda 2-0 em uma agulha conicidade em dois locais, de modo que o fio ou sonda de fluxo não é capaz de colocar qualquer pressão sobre o recipiente. Certifique-se suturas são confortável, mas não aperte demasiado e estrangular musculatura (Figura 3). </li><li> Sutura da linha de fios de cristal e cateter arterial para a musculatura lateral, permitindo a ~ 1,5 centímetros de folga, semelhantes aos passos anteriores para fixar sonda de fluxo (Figura 3). </li><li> Grupo todos os fios e linhas juntas e ancorá-las a musculatura pouco antes de sair para fora através de túnel subcutâneo, similar às etapas anteriores. </li></ol></li><li> Feche o local da cirurgia com um 2-0 Vicryl sutura em camadas usando um padrão de sutura em execução no tablier e subdérmico, correndo colchão pontos na pele (tablier, agulha não cortante; pele, agulha cortante). Feche a 1,5 centímetros incisão no pescoço dorsal ao redor dos fios e linhas exteriorizados usando 2/0 Vicryl e uma agulha de corte. </li><li> Coloque fios da sonda de fluxo, linhas e fios, cateteres de ultra-sons de cristal em uma bolsa (10 cm x 10 cm) que está firmemente suturadas na pele das ovelhas (Figura 5 - depois de recuperação). </li><li> Gradualmente desmamar as ovelhas off anestesiaeo ventilador volume corrente, em seguida, extubação as ovelhas quando a respiração espontânea é retomada. Remover o angiocath inserido na veia cefálica e curativo, se necessário. </li><li> Enfaixar o pescoço usando pomada antibiótica tripla sobre as incisões, uma almofada de Telfa, gaze rolo estiramento, e elasticon. </li><li> Administrar analgesia pós-operatória: meglumina flunixin 2,2 mg / kg IM uma vez durante a recuperação, em seguida, 1,1 mg / kg IM, uma vez por dia durante dois dias, a buprenorfina 0,005-,01 mg IV ou IM, duas vezes por dia, durante um dia. </li></ol> 3. Monitorização In Vivo <ol><li> Coloque ovelhas no carrinho móvel para assegurar a contenção adequada. Isso permite que as ovelhas para manter a calma e consciente, sem comprometer o hardware. Pode ser necessário aclimatar ovelhas ao carrinho 2 ou 3 vezes por 30 minutos antes de obter gravações de instrumentação. </li><li> Remova todos os fios e linhas de bolsa e conectar-se aos dispositivos de monitoramento. Conecte-sonda de fluxo a um medidor de vazão, cristais um milímetro de ultra-som ligado a TRB-USB Caixa, e do cateter linhas para transdutores de pressão. Um fluxograma desta instalação é fornecida (Figura 6). </li><li> Calibrar sondas de fluxo e transdutores de pressão antes de aquisição de dados. NOTA: Devido à variabilidade de potencial entre as versões de software e as diferenças de equipamento utilizado, calibrações e ajustes irão variar de caso para caso. </li><li> Utilize um osciloscópio para afinar a medição de cristal Sonometrics, de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Gravar dados usando o software de computador (Figura 7). Traços na metade superior da Figura 7 em cor branca corresponde ao TEV implantado, enquanto os traços na metade inferior da cor vermelha corresponde ao engodo / nativo. Para tanto a TEV e Sham o caudal (ml / min), a pressão sanguínea arterial (mm Hg) e do diâmetro (mm) são registadas ao vivo. </li><li> Record para, pelo menos, 1 min sem perturbações. Exportar esses dados para uma análise mais detalhada. Depois da gravação, DISCONNect todos os fios e lugar de volta para bolsa suturado no pescoço das ovelhas. </li></ol>

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There are no disclosures to report.

O objetivo deste relatório é fornecer um procedimento confiável e reprodutível para TEVs implante de interesse na artéria carótida ovinos. As artérias carótidas nativas dos animais utilizados neste modelo foram 0,5-0,75 mm de espessura e 4,5-5 mm de diâmetro externo. A técnica cirúrgica descrita aqui tem sido bem sucedida para a implantação TEVs de diferentes geometrias de medição 0,25-1 mm de espessura, de 4-5 mm de diâmetro externo e 4 cm de comprimento, com grande sucesso provando eficaz até duraçã...

O foco principal para o desenvolvimento de TEVs tem sido fornecer um substituto para a substituição de enxerto autólogo quando os vasos autólogos não estão disponíveis e limitar doador vista morbidade. Por exemplo, o número de cirurgias de revascularização do miocárdio por ano ultrapassou 350 mil nos EUA, e a fonte ideal de enxertos adequados continua a ser a artéria mamária interna esquerda, descendente anterior da artéria coronária e uma veia safena. Uma vez que muitos indivíduos que sofrem de doenças vasculares pode não ter artérias e veias adequadas para a substituição de enxerto autólogo, o desenvolvimento de TEVs tornou-se assim um campo de intensa pesquisa por décadas 1-6. Enquanto a engenharia e otimização de novos TEVs passaram por muitos avanços, informando sobre as técnicas cirúrgicas utilizadas para implantar os TEVs si não tem sido um tema de tal discussão intensa. Em vez disso, os protocolos relativos à implantação de TEVs em modelos animais são em grande parte à esquerdaaté investigadores pesquisar. O seguinte demonstra como manuscrito para implantar TEVs utilizando uma abordagem anastomose extremidade-a-extremidade. Este processo foi optimizado usando um padrão específico de sutura da anastomose, estabilizando técnica de sutura, optimizando a tensão longitudinal e a adição de instrumentação de monitorização in vivo. Este método é contrastado com algumas das muitas variações que têm sido utilizadas anteriormente. Além disso, este procedimento descreve como adquirir parâmetros tais como pressão arterial, TEV diâmetro / compliance e taxa de fluxo através do TEV após cirurgia até explante. Esta recolha de dados proporciona uma análise indispensável do TEV enquanto ele está no processo de remodelação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1505">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:335px;">Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Manufacturer</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">Serial/Catalog #</td>
			<td dir="LTR" style="width:363px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td dir="LTR" height="94" rowspan="2" style="height:94px;width:335px;">Pressure Transducer</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Becton Dickinson</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">P23XL-1</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1+ (1 for each artery) 
			&#160;Used with water-filled diaphragm domes</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td dir="LTR" height="172" style="height:172px;width:335px;">Amplifier and transducer box</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Gould</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">5900 Signal Conditioner Cage</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1 
			Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td dir="LTR" height="121" style="height:121px;width:335px;">T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module(x2)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Transonic Systems</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">T403 module and TS420 (x2)</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1 
			Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td dir="LTR" height="126" style="height:126px;width:335px;">Digital ultrasonic measurement unit</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Sonometrics</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">TR-USB</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td dir="LTR" height="48" style="height:48px;width:335px;">Flow Probe Precision S-Series 4mm</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:208px;">Transonic Systems Inc.</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:311px;">MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:291px;">2</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="49" rowspan="2" style="height:49px;width:335px;">1mm&#160; Sonometrics Crystals</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Sonometrics Systems</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">1R-38S-20-NC-SH</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">&#160;2-4 (2 for each artery)</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td dir="LTR" height="134" rowspan="2" style="height:134px;width:335px;">Catheter for implantation</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">BD (Becton Dickinson)</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">&#160;381447</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">&#160;1+ (1 for each artery) 
			Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="73" rowspan="2" style="height:73px;width:335px;">Tygon Microbore Tubing</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Norton Performance Plastics</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">(AAQ04127) Formulation S-54-HL</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">NA (cut to length for an extension set)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="49" rowspan="2" style="height:49px;width:335px;">Luer Stub Adapter</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">BD (Becton Dickinson)</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">427564 (20 gauge)</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1+ (1 for each arterial catheter)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="82" rowspan="2" style="height:82px;width:335px;">Surflo Injection Plug</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Terumo</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">SR-IP2</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1+ (1 for each arterial catheter)</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td dir="LTR" height="128" rowspan="2" style="height:128px;width:335px;">Meadox</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">PTFE (Teflon) Felt</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">19306</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">NA (cut to size) 
			The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as &#8220;Surgical Mesh&#8221; offer products which are equivalent.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical technique for the implantation of tissue engineered vascular grafts and subsequent in vivo monitoring

O desenvolvimento da engenharia de tecidos de vasos (TEVs) é avançada pela capacidade de TEVs habitual e efectivamente implante (4-5 mm de diâmetro) em um modelo animal de grande porte. Um protocolo de passo a passo para colocação inter-posicional da avaliação digital de TEV e em tempo real de TEV e artérias carótidas nativas é descrito aqui. In vivo, a monitorização é tornada possível pela implantação de sondas de fluxo, cateteres de ultra-sons e cristais (capaz de gravar mudanças dinâmicas diâmetro de TEVs implantados e artérias carótidas nativas) no momento da cirurgia. Uma vez implantado, os pesquisadores podem calcular padrões de fluxo sanguíneo arterial, pressão arterial invasiva e diâmetro da artéria rendendo parâmetros como a velocidade da onda de pulso, índice de aumento, pressão de pulso e conformidade. A aquisição de dados é conseguida utilizando um único programa de computador para análise ao longo da duração da experiência. Tais dados inestimável fornece insights sobre TEV remodelação da matriz, a sua resemblanCE para controles nativos / farsa e desempenho geral TEV in vivo.

Mais de 30 ovelhas foram submetidas a técnica cirúrgica descrita neste relatório para a implantação de TEVs (no prelo) 9. Uma tabela que resume as operações mais recentes ovelhas após a otimização de protocolo são apresentados na Tabela 2. Todos os animais recuperaram após a implantação TEV sem complicações fatais. Em alguns animais, fibrose foi observada em artéria nativa perto da ponta do cateter arterial. Não foi observado um aumento significativo de inflamação com a pr...

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Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Um protocolo de passo-a-passo para a colocação inter-posicional de engenharia de tecidos Vessels (TEVs) na artéria carótida de um carneiro usando anastomose end-to-end e avaliação digital em tempo real, in vivo até o sacrifício animal.

Técnica Cirúrgica para a Implantação de engenharia de tecidos enxertos vasculares e Subsequente<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

surgical-technique-for-implantation-tissue-engineered-vascular-grafts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

11.6K visualizações.  State University of New York Buffalo School of Medicine.  Um protocolo de passo-a-passo para a colocação inter-posicional de engenharia de tecidos Vessels (TEVs) na artéria carótida de um carneiro usando anastomose end-to-end e avaliação digital em tempo real, in vivo até o sacrifício animal. 

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Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

Imagem bioluminescência para avaliação das respostas imune após o implante do tecido do coração Engineered (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Bioengenharia

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

A escala do Engineered enxertos vasculares Usando 3D Impresso Guides and the Ring método de empilhamento

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.