O câncer de mama é uma doença prevalente e mortal com estratégias de prevenção limitadas que vêm com efeitos colaterais negativos graves. Para fornecer um método com efeitos colaterais reduzidos, desenvolvemos uma técnica para injeção intraductal de uma solução ablativa à base de etanol para a árvore ductal mamária de ratos que permite imagens simultâneas in vivo e prevenção do câncer de mama. Isso se baseia em trabalhos anteriores em camundongos em que a injeção diretamente na abertura do mamilo permite atingir células epiteliais mamárias com danos mínimos nos tecidos colaterais.
Tanto os ratos como os ratos têm glândulas mamárias contendo uma única árvore ductal originária da abertura do mamilo. Os ratos são maiores que os camundongos e permitem a injeção de um volume maior de etanol para estudo do sucesso da ablação para comprovar a escalabilidade do modelo. Outro refinamento para este método é a adição de celulose etílica à solução ablativa.
A etilcelulose tem sido usada anteriormente em outras abordagens clínicas para reduzir a disseminação do etanol para longe da área visada. Isto é conseguido através da natureza do composto, o que faz com que ele gelifique quando entra em contato com o fluido no tecido. Existem cinco etapas principais envolvidas neste método de prevenção do câncer de mama verificado por imagem.
Devemos primeiro começar a dosar animais com carprofeno por via oral utilizando copos de gel de sucralose preparados em laboratório. Este tratamento anti-inflamatório prolongado é mantido pré e pós-processualmente. Em seguida, removemos a pele da área ao redor dos mamilos para ser injetada com creme depilatório para preparar o animal para injeções.
As injeções intraductais são então realizadas com um estereoscópio que auxilia a visualização da abertura do mamilo para a inserção da agulha. Os animais são escaneados ou avaliados por microtomografia computadorizada ou fluoroscopia após a injeção para determinar o sucesso das injeções. As varreduras de microtomografia computadorizada podem então ser processadas para criar reconstruções 3D da árvore ductal mamária injetada para uma análise mais aprofundada do enchimento bem-sucedido.
O carprofeno de estoque é primeiro diluído em PVS para a concentração necessária. Corante alimentar estéril pode ser adicionado à mistura para confirmar melhor a mistura completa da droga na sucralose do copo. Os copos são então aquecidos em banho-maria a 60 graus Celsius por 15 minutos.
Secar os copos após a remoção e limpar a tampa do copo com etanol a 70% reduz o risco de contaminação. A solução de carprofeno pode ser injetada diretamente no copo usando uma seringa para perfurar a tampa. Neste caso, precisamos injetar 500 microlitros para o resultado desejado.
Sele o orifício com um adesivo antes de agitar o copo por 15 segundos e, em seguida, vórtice por mais 15 segundos. A mistura homogênea pode ser avaliada procurando por aglomerados de azul escuro. Os copos podem então ser refrigerados até que seja necessário.
Os animais devem ser preparados dois a três dias antes da ocorrência das injeções. Anestesiar o animal utilizando isoflurano inalante. Transfira o rato anestesiado para um cone de nariz em uma almofada de aquecimento.
Aplique lubrificante ocular no rato enquanto estiver no cone do nariz e, em seguida, posicione o animal de costas. O creme depilatório pode ser aplicado na área dos mamilos que você planeja injetar com um aplicador com ponta de algodão. O afrouxamento mais rápido da pele pode ser conseguido esfregando o aplicador para cima e para baixo em toda a pele do animal na área desejada.
É importante deixar o creme no rato pelo menor tempo possível para evitar queimar a pele. Os ratos são ainda mais sensíveis do que os ratos a este procedimento. Após 10 a 30 segundos de aplicação, use água morna na gaze para remover completamente o creme.
Use três a quatro enxaguamentos para garantir a remoção completa antes de secar a pele com gaze limpa. Confirme a boa visibilidade e acesso aos mamilos nas áreas de remoção de pelos. Repita o procedimento depilatório, se necessário.
Coloque o rato em uma gaiola de recuperação limpa em uma almofada de aquecimento para se recuperar da anestesia. Dê um copo de carprofeno para ratos preparados em sua gaiola doméstica após a recuperação. Você começará anestesiando o animal usando anestesia inalante com isoflurano e moverá o rato para um cone nasal uma vez que tenha sido totalmente induzido.
O lubrificante ocular deve ser aplicado antes de colocar o animal de costas para injeções. Pode ser útil adescer as pernas perto dos mamilos que serão injetados, mas não é necessário. Depois de ter preparado a seringa com o volume desejado de solução de injeção, prepare o mamilo removendo qualquer pele morta visível usando pinça de ponta fina, se possível.
A área de preocupação mais comum é a própria abertura do mamilo. Os ratos geralmente têm um plugue que se projeta da abertura. A remoção deste plugue pode ajudar na melhor canulação.
Com o bisel da agulha visível, insira a agulha na ponta do mamilo com a ajuda de orientação de pinças de ponta fina. Tome cuidado para seguir o caminho da abertura do mamilo. Mamilos de rato tendem a ter mais gordura ao redor da abertura, facilitando a perfuração dessa gordura e acreditam erroneamente que você alcançou a canulação devido ao avanço da agulha.
Uma vez que o bisel da agulha esteja totalmente cercado pelo mamilo, comece a injetar lentamente a solução. A taxa desejada é de aproximadamente 100 microlitros por minuto em ratos. Evite injetar mais rapidamente do que isso para evitar possíveis danos à árvore ductal.
Após a injeção completa, aguarde 30 segundos antes de remover a agulha do mamilo com a ajuda da pinça. Isso diminuirá a probabilidade de vazamento do mamilo. Se ocorrer vazamento, use gaze umedecida ou um lenço umedecido para limpar a solução.
O contraste e a solução derramada podem distorcer as imagens adquiridas. Aqui vemos um vídeo ampliado da sequência de injeção que acabou de ser exibida. Observe que a respiração do animal dificulta a manutenção do mamilo em um único plano focal.
Isso pode tornar a injeção mais difícil, pois o mamilo não permanece em um local constante. Este problema é exacerbado pela proximidade da caixa torácica e dos três principais pares de glândulas. O plugue na abertura do mamilo já foi removido para melhor canulação.
A agulha pode agora ser orientada chanfro para cima para ser avançada no mamilo com a ajuda da pinça. Uma vez que o bisel esteja totalmente inserido, a injeção pode começar. Se você olhar cuidadosamente para o lado esquerdo do mamilo, você pode notar um aumento na tonalidade azul, onde a solução de injeção é ligeiramente visível espalhando-se através da árvore ductal.
Isso é muito menos visível no rato devido à pele mais espessa. Aqui podemos ver a remoção da agulha 30 segundos após a conclusão da injeção e a solução resultante derramando para fora do mamilo. A solução extra é limpa, permitindo a avaliação da área onde não vemos trauma no mamilo ou na cúpula da área, o que indicaria uma injeção de almofada de gordura.
Se injetar uma solução contendo etanol, deve-se tomar cuidado para evitar a intoxicação alcoólica. Isso requer saber quanto etanol pode ser injetado em uma sessão e administrar solução contendo sacarose IP durante o procedimento para neutralizar os efeitos. Após a injeção, os animais podem ser recuperados numa gaiola limpa numa almofada de aquecimento ou transferidos para a microTC para imagens do sucesso da injecção.
Depois de mover o animal injetado para o instrumento de microTC, continue administrando isoflurano para manter a anestesia durante a imagem. O aumento do tamanho do rato requer manipulação de posição adicional para alcançar uma boa imagem. O endireitamento da coluna antes de prender as pernas perto do local a ser fotografado é útil para gerar imagens consistentes.
Bater as pernas em uma posição estendida pode impedir que os ossos se tornem o ponto focal da imagem. Também descobrimos que a gravação em todo o abdômen do rato pode ajudar na redução do artefato respiratório para as glândulas inferiores. Vários parâmetros de varredura são aceitáveis para visualização do tratamento ductal.
No entanto, a dose de radiação deve sempre ser considerada ao selecionar parâmetros. A dose de radiação resultante destes exames não deve exceder os limites de radiação para uma determinada estirpe de ratos. A análise fluoroscópica, em vez da aquisição de imagens, pode reduzir muito a carga geral de radiação.
Uma vez que todos os exames ou avaliações tenham sido feitos, o animal pode ser devolvido a uma gaiola de recuperação limpa em uma almofada de aquecimento. O animal deve ser monitorado até que seja totalmente recuperado e devolvido à gaiola de origem. Devem ser administrados copos de carprofeno até, pelo menos, sete dias após a injeção.
O software do instrumento de microTC que utilizamos permite a criação de rendições rápidas para avaliar o sucesso da injeção sem análise formal. Este recurso tem um controle deslizante de contraste simples que permite uma redução razoável de sinal para ruído. A principal falha nessas representações é que toda a imagem deve ser nivelada simultaneamente.
Isso permite que sinais brilhantes que claramente não fazem parte da árvore ductal, como o ferro na dieta, permaneçam na imagem. Em alguns casos, o sinal verdadeiro, como visto aqui, é tão fraco quanto o plano de fundo e pode ser facilmente eliminado da imagem. Melhores interpretações formais podem ser feitas usando softwares de análise mais sofisticados que permitem a segmentação da área de interesse.
É melhor segmentar a almofada de gordura mamária para processamento de imagem adicional, a fim de obter a melhor interpretação da árvore ductal injetada. O limite escuro da almofada de gordura mamária pode ser traçado em toda a espessura completa do animal, a fim de alcançar essa segmentação. Rastrear cada terceira fatia e propagar o objeto é suficiente para capturar a totalidade do duto em nossa experiência.
Neste ponto, é possível nivelar a representação usando uma determinada raiva para exibir apenas o contraste contido dentro da almofada de gordura mamária. Isso deve incluir a solução dentro da árvore ductal, bem como qualquer vazamento nas imediações. As soluções de óxido de tântalo são geralmente bem exibidas em uma faixa de 300 a 3000 HU. Uma análise mais aprofundada pode ser formada uma vez que você criou uma reconstrução da árvore ductal.
Se a imagem longitudinal não for desejada, imagens de maior resolução que melhor capturem a arquitetura complexa da árvore ductal podem ser adquiridas. As diferenças entre os animais podem tornar a injeção mais ou menos difícil. Não podemos falar de variabilidade de tensão para deformação, pois atualmente trabalhamos exclusivamente com ratos Sprague Dawley.
Alguns animais terão mamilos com perfis baixos, como o retratado aqui, dificultando a manipulação e a canulação bem-sucedida. Outros terão mamilos com um perfil mais alto, como o mostrado aqui, que serão mais passíveis de canulação. Um mamilo canulado com sucesso é representado aqui.
A dificuldade em canular pode resultar em trauma no mamilo, como mostrado aqui. A aquisição de imagens de microTC imediatamente após a injeção pode informar melhor os pesquisadores sobre o sucesso de uma injeção, bem como ajudar a identificar as propriedades de enchimento de certas soluções. Aqui vemos diferentes aspectos das glândulas abdominais de um mesmo rato injetado com o mesmo volume de uma solução ablativa contendo etanol a 70% com contraste fornecido por óxido de tântalo 100 milimolares.
A solução utilizada na glândula superior mostrada também continha celulose a 1%etila. Vemos estruturas semelhantes a paredes nas extremidades dos ramos ductais. Estes são fones terminais preenchidos com a solução e não transbordando.
Na linha inferior, vemos extremidades ductais menos definidas indicando o escape da solução da árvore ductal. Isso, juntamente com danos colaterais mais limitados no exame histológico. parece indicar melhor retenção de soluções contendo etilcelulose para a árvore ductal.
Este método fornece um passo em direção à escalabilidade de um método menos invasivo de prevenção do câncer de mama para oferecer uma alternativa para a mastectomia profilática. A ablação epitelial bem-sucedida em um modelo de roedor maior foi demonstrada com efeitos colaterais mínimos para o animal. A adição de etilcelulose à solução ablativa permite uma melhor retenção da solução na área de injeção, o que resulta em danos colaterais reduzidos.
O novo uso de soluções que foram clinicamente comprovadas e a capacidade adicional de visualizar o sucesso da entrega com modalidades de imagem comuns permitem uma tradução pronta para a clínica.
