Este protocolo ajudará os pesquisadores a gerar um novo tipo de modelo de camundongo para recapitular o desenvolvimento do câncer de mama humano a partir de diferentes subconjuntos de células epiteliais mamárias. Essa técnica permite que os pesquisadores gerem modelos de camundongos com câncer de mama em tecido de estágio de desenvolvimento de forma específica do tipo celular e sem a necessidade de criação extensiva de camundongos. Para iniciar esse procedimento, gerar, manter e anestesiar camundongos floxed como descrito no protocolo de texto.
Leve o rato para uma área separada de onde a cirurgia deve ser realizada. Após confirmar a anestesia realizando uma pitada de dedo do pé, injete Meloxicam como analgesia subcutânea a uma dose de cinco miligramas por quilograma para se preparar para o procedimento cirúrgico. Exponha o local cirúrgico do mamilo aplicando várias gotas de creme para depilação.
Remova o creme excessivo e os cabelos soltos usando toalhas de papel macios. A barba não é recomendada para evitar danos aos mamilos. Desinfetar o local cirúrgico com iodophors primeiro seguido por 70% de álcool e terminar com uma aplicação final de iodophors de esfoliação.
Faça isso em um movimento circular do centro da área de trabalho em direção à periferia usando uma esponja de gaze ou um aplicador de ponta de algodão. Repita o ciclo três a quatro vezes. Use técnicas assépticas durante todo o procedimento cirúrgico.
Faça um local de incisão na pele em um comprimento de aproximadamente um centímetro entre as duas quatro glândulas mamárias inguinais. Separe cuidadosamente a aba da pele do peritônio parietal para visualizar a árvore ductal mamária. Segure cuidadosamente o mamilo com fórceps relojoeiros para remover o mamilo exterior sem cortar nenhuma pele próxima usando uma tesoura de microdisseção.
Carregue aproximadamente três a cinco microliters da mistura de injeção de Cre-adenovirus em uma seringa Hamilton de 25 microliter com uma agulha de hub metálico de calibre 33 afixada. Estime o volume da mistura de injeção na seringa à base do corante azul incluído na mistura. Segure suavemente a borda da aba da pele com uma pinça curva fina e injete a mistura de injeção de Cre-adenovírus lentamente no mamilo enquanto monitora a propagação de corante azul na árvore ductal mamária.
Mantenha a taxa de injeção o mais lenta possível para evitar danos ao lúmen ductal. Uma injeção intradutora bem sucedida é indicada por fluidos injetados espalhados por toda a árvore ductal sem vazar para o compartimento estroma. Retire suavemente a agulha do mamilo para evitar qualquer vazamento do fluido injetado.
Examine o lado distal da glândula mamária ou a área circundante do mamilo injetado. Dilatação de corante no estroma próximo, como mostrado aqui indica uma injeção de almofada de gordura mamária em vez de uma injeção intradutal bem sucedida. Feche as feridas cirúrgicas na pele com clipes de ferida.
Retire o rato da anestesia e coloque-o em uma almofada de aquecimento dentro de uma gaiola limpa para recuperação. Monitore o desenvolvimento do tumor mamário conforme descrito no protocolo de texto. Os camundongos fêmeas mais jovens para os quais a injeção intradutal pode ser realizada com sucesso são aqueles com aproximadamente três semanas de idade.
Embora para a maioria dos experimentos de indução de tumores mamários, camundongos adultos jovens são usados. A injeção intraducional com um volume maior da mistura de injeção pode ser realizada em camundongos fêmeas durante a gestação precoce e média para atingir células alveolares. Para atingir diferentes subpopulações de células epiteliais mamárias para indução de tumores mamários, foram utilizados promotores de células epiteliais sob o controle de diferentes subconjuntos de células epiteliais mamárias para injeção.
Por exemplo, cre-adenovírus sob o controle da queratina 8 promotor foi usado para atingir células epiteliais luminais mamárias. Cre-adenovírus sob o controle da queratina 5 promotor teve como alvo a linhagem basal que leva à marcação genética de apenas células epiteliais mamárias basais. Para uma fêmea P53 floxed homozygous camundongos com um repórter ROSA26-YFP, a injeção intradutal de queratina 8 Cre-adenovírus levou ao desenvolvimento de tumores mamários vários meses após a injeção.
Devido à inclusão do repórter condicionado R26-Y, as células epiteliais tumorais eram tipicamente marcadas por YFP e podiam ser detectadas por citometria de fluxo. As células podem ser enriquecidas pela triagem de fluxo de células positivas YFP para análise posterior. As coisas mais importantes a serem lembrada ao tentar este procedimento são usar um pequeno volume de injeção, injetar lentamente e também retirar a agulha lentamente.
Após este procedimento, pode-se monitorar a progressão das células epiteliais mamárias positivas YFP direcionadas para estágios pré-malignos e cancerígenos por citometria de fluxo ou coloração de co-imunofluorescência da glândula injetada. Essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores estudarem células de origem do câncer de mama, como elas respondem a diferentes eventos autogênicos e como elas progridem para as células cancerosas. Tanto o adenovírus quanto a agulha para injeção são potencialmente perigosos.
Portanto, deve-se sempre usar luvas e usar agulhas de segurança e seringas ao realizar injeção intraducional.
