Usando essa ferramenta sofisticada e não invasiva, podemos monitorar em tempo real cinética de crescimento de tumores e colonização metastática em camundongos, que tem um grande potencial no tratamento terapêutico e de doenças do câncer de mama. A combinação de detecção de luciferase e fluorescência é uma estratégia útil para avançar nos estudos pré-clínicos de progressão do câncer de mama e manejo de doenças. Isso pode ser aplicado para estudos de drogas anticancerígenas.
Este protocolo não se restringe ao câncer de mama e pode ser aplicado a outros carcinomas, como pulmão e pâncreas. Comece cultivando as células MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 GFP e luciferase-positive separadamente em uma placa de 16 centímetros a 80% de confluência. Depois de colher as células por trippsinização, as sementes aumentaram um número crescente de células em cada poço em uma placa preta de 96 poços.
Em seguida, encha todos os poços com 100 microliters de DMEM, e incubar por 16 a 24 horas em 37 graus Celsius, incubadora de 5%DE CO2. Prepare a solução de luciferina em PBS a uma concentração de 1,5 miligramas por mililitro, e armazene a solução a menos 20 graus Celsius. Após a incubação, lave as células uma vez com PBS suavemente antes de adicionar 100 microliters de solução de luciferina em cada poço.
Espere por dois minutos e, em seguida, meça a atividade da luciferase em todas as células cancerígenas de mama usando bioluminescência. Antes de injetar o mouse, transfira cinco milhões de células MCF-7 e MDA-MB-468 em 200 microliters de PBS e dois milhões de células MDA-MB-231 GFP e luciferase-positiva em 100 microliters PBS. Prepare o rato anestesiado para injeção colocando um cone sobre a cabeça em uma posição supina.
Em seguida, limpe a área abdominal do rato acima da glândula mamária com etanol usando um cotonete, e levante a quarta glândula mamária com fórceps antes de inserir uma agulha de calibre 27 sob a almofada de gordura para injetar lentamente 100 microliters da suspensão celular preparada. Após a injeção, tire o rato do capô e transfira-o para uma nova gaiola sob observação até que ele retorne à consciência. Antes da detecção da bioluminescência, contenha o rato consciente segurando o pescoço com a mão esquerda e inclinando a mão para a esquerda, resultando na face do mouse para cima com o corpo inferior em uma posição supina.
Injete 100 microlitres de 30 miligramas por mililitro luciferin intraperitoneal no quadrante abdominal inferior esquerdo do mouse usando uma seringa de um mililitro. Mantenha o rato por sete minutos sem anestesia, seguido de três minutos dentro da câmara de anestesia antes de medir a cinética tumoral. Enquanto o mouse estiver sob incubação, abra o software e inicialize o sistema de imagem clicando no botão Initialize.
Mantenha a configuração em exposição automática com tempo de exposição no automático em 60 segundos, binning médio em uma abertura de f/stop um, filtro de excitação bloqueado e filtro de emissão aberto. Quando a inicialização terminar, selecione Assistente de Imagem e Bioluminescência e clique em Seguir, Abra filtro para selecionar mouse no objeto de imagem. Na visão de campo, selecione o estágio C a 10 centímetros e a altura do sujeito a 1,50 centímetros.
Em seguida, clique no Palco de Configuração da imagem para C.Certifique-se de que o mouse é colocado no palco na posição supina adequada antes de fechar a porta e clicar no botão Adquirir. Aguarde que uma imagem apareça na tela. Repita o procedimento para o outro rato.
Para detectar a metástase pulmonar, cubra o forte sinal do tumor primário usando um papel de papelão espesso e exponha apenas o lado ventral dos pulmões em direção à câmera. Capture a imagem usando os mesmos parâmetros descritos anteriormente. As linhas de células cancerígenas de mama foram infectadas com um vetor de lentivírus expressando GFP fluorescente e sujeito à classificação FAC.
As células GFP-positive foram classificadas dois dias após a infecção, emplacaram e visualizadas pelo microscópio de fluorescência. A atividade de luciferase in vitro foi confirmada com aumento de número de células dependentes dos níveis de atividade da luciferase. Além disso, foi encontrada correlação linear entre a atividade da luciferase e o número celular.
Após injetarem as linhas celulares cancerígenas de mama, os camundongos foram submetidos à leitura de bioluminescência a cada duas semanas para determinar a cinética de crescimento do tumor. A cinética de crescimento do tumor foi mais rápida nas linhas celulares MDA-MB-231 do que nas linhas celulares menos agressivas, MCF-7 e MDA-MB-468. A atividade de luminescência foi quantificada para três linhas celulares.
Seis semanas após a injeção, os tumores colhidos foram encontrados para manter a expressão GFP. Além disso, foram obtidas leituras positivas de bioluminescência do pulmão de todo o camundongo em tempo real. O pulmão foi colhido para verificar colônias metastáticas positivas, e as colônias metastáticas foram observadas para GFP e bioluminescência.
É mais importante ter cuidado durante a realização do procedimento de injeção. Uma injeção imprópria pode levar a desvio na taxa de crescimento do tumor ou ausência de tumor. Podemos examinar a metástase pulmonar in vivo e ex vivo detectando a expressão GFP.
Além disso, também podemos estudar a histopatologia dos pulmões por manchas à base de imunohistoquímica. Essa técnica pode ser útil para explorar as novas questões, como o efeito dos estudos de eficácia de medicamentos.
