Nossa capacidade de prever com precisão como os seres humanos respondem a drogas durante ensaios clínicos é limitada devido à falta de modelos pré-clínicos fisiologicamente relevantes. Esse sistema microfisiológico pode resolver essa disparidade. Este sistema derivado de células humanas imita com precisão toda a natureza de doença articular da osteoartrite no joelho humano, o que permite o teste de drogas modificadoras da doença para osteoartrite antes dos ensaios clínicos, potencialmente economizando milhões de dólares.
Comece a preparar a gelatina metacrilada, ou GelMA, adicionando 17 gramas de gelatina tipo B a 500 mililitros de água destilada. Misture por 30 minutos em um agitador a 37 graus Celsius e adicione 13 mililitros de anidrido metacrílico antes de misturar durante a noite em um agitador. No dia seguinte, prepare cerca de 60 mililitros de alíquotas do GelMA em bolsas de diálise.
Coloque todos os sacos de diálise em água destilada com uma barra de agitação por sete dias. Troque a água várias vezes ao dia e deixe os sacos a quatro graus Celsius durante a noite. No sétimo dia, despeje o GelMA em um prato e congele-o a menos 80 graus Celsius antes da liofilização.
Em seguida, liofilize o GelMA colocando-o na câmara de vácuo de um liofilizador. Assegure-se da secagem completa antes da remoção do liofilizador. Em seguida, dissolver o GelMA liofilizado em solução salina balanceada de Hanks na concentração de 15% e ajustar o pH para 7,4 usando uma pequena quantidade de hidróxido de sódio.
Com base no volume adquirido, complementar a solução com antibiótico antimicótico e fenilfosfinato de lítio a 0,15%, ou LAP. Proteja a solução de GelMA da luz e guarde-a a menos 20 graus Celsius até uma nova utilização. Autoclave 3D imprimiu câmaras de biorreator de fluxo duplo, tampas e insertos em sacos de autoclave a 121 graus Celsius por 20 minutos com vapor.
E depois, por 20 minutos com fogo seco. Após a esterilização, mergulhe as câmaras do biorreator, tampas e pastilhas em 15 mililitros de PBS estéril durante a noite dentro do gabinete de biossegurança, seguido de secagem completa. Usando uma pipeta de 1000 microlitros, ressuspenda 20 vezes 10 até a sexta célula-tronco mesenquimal derivada da medula óssea humana, ou CTMs, por mililitro de células em uma solução de GelMA a 15%.
Em seguida, pressione um molde de silicone seco e estéril contra uma placa de Petri, usando luvas estéreis. Coloque uma pastilha em cada orifício do molde de silicone com pinça com o lado do furo da pastilha voltado para baixo. Uma vez feito, adicione cerca de 50 microlitros da suspensão celular por pastilha usando uma pipeta de 200 microlitros.
Cruze o gel dentro da pastilha expondo a parte superior a uma lanterna UV de 395 nanômetros de comprimento de onda por 1,5 minutos e, em seguida, iluminando o outro lado por 30 segundos. Com pinças estéreis, transfira imediatamente as pastilhas para oito mililitros de meio de crescimento em uma placa de seis poços de cultura não tecidual e permita que as células se recuperem durante a noite. Para iniciar a diferenciação do tecido adiposo, transferir as pastilhas para oito mililitros de meio adipogênico e cultivá-las por 28 dias com troca diária do meio.
Para projetar as unidades osteocondrais, coloque as pastilhas em câmaras de biorreator de fluxo duplo, tampe os poços e infunda as duas correntes separadamente a uma taxa de fluxo de cinco microlitros por minuto com 35 mililitros de meio osteogênico e 35 mililitros de meio condrogênico. Manter as células para diferenciação por 28 dias, realizando trocas quinzenais de seringas com os respectivos tipos de meios. Para derivar os fibroblastos, diferenciar as CTMs em cultura 2D em frasco de cultura de células de tecido T de 150 centímetros quadrados contendo 20 mililitros de meio fibrogênico por 21 dias.
Manter a mudança semanal do meio. Após 21 dias, use quatro mililitros de tripsina para desprender as células. Encapsular os géis 3D dentro das pastilhas.
Para obter tecido fibroso semelhante ao sinovial, ou TFS, siga um protocolo semelhante. Conecte a tubulação de silicone, com um diâmetro interno de 0,062 polegadas e um diâmetro externo de 0,125 polegadas, à barra do biorreator minijoint em uma extremidade e aos conectores de bloqueio de isca F 1/16th na outra extremidade. Em seguida, autoclave os biorreatores de minijunta 3D juntamente com a tubulação de silicone e as tampas.
Preparar e carregar 35 mililitros de meio a ser usado para a cultura minijoint nos reservatórios médios. Use pinças retas para transferir as unidades osteocondrais do biorreator de fluxo duplo para o poço direito do biorreator miniarticular. Transfira a inserção de tecido adiposo e a inserção de tecido fibroso para os poços esquerdo e médio, respectivamente, antes de cobrir todos os poços com tampas esterilizadas.
Conecte as entradas do clipe de minijunta aos reservatórios médios e as saídas às seringas. Em seguida, monte as seringas em uma bomba de seringa. Transfira a bomba e os cavacos para uma incubadora.
Coloque os reservatórios médios no gelo fora da incubadora. Opere a bomba no modo de retirada, puxando o meio do reservatório médio para a câmara do biorreator miniarticular. Continue este processo de cultura miniconjunta por 28 dias.
Para modelar a inflamação articular e a degeneração da cartilagem, adicione interleucina um beta à cepa do meio fibrogênico a 10 nanogramas por mililitro por sete dias. Certifique-se de substituir a seringa no terceiro dia antes de fornecer interleucina fresca um beta para o meio fibrogênico. Para o teste da droga, após três dias do tratamento com interleucina um beta, administrar a droga no meio compartilhado, simulando uma administração intra-articular, ou em todos os tipos de meio, simulando uma administração sistêmica.
Após sete dias de tratamento com interleucina um beta, colete tecidos individuais para a análise. Depois de remover as pastilhas usando pinças estéreis, empurre um punch de biópsia através do centro da inserção para remover o gel e coloque o gel em PBS. Em seguida, cortar os géis osteocondrais ao meio enquanto se avalia a expressão gênica.
Recolher e centrifugar cerca de 1,5 mililitros de meio de cada fonte média a 14.000 G durante 10 minutos. Após o descarte do sedimento, congelar rapidamente o meio condicionado em nitrogênio líquido. Para coloração histológica e imunomarcação, primeiramente, fixar as amostras de tecido fibroso osteocondral e sinovial, ou SFT, em formalina tamponada a 10% e desidratá-las em etanol de concentrações crescentes.
Limpar a amostra em xileno, incorporá-la em parafina e, finalmente, seccionar as amostras em seis micrômetros de espessura. No caso de tecido adiposo, corar diretamente as amostras formais e fixas tamponada a 10%, com solução de óleo vermelho O ou BODIPY. Os fenótipos específicos do tecido foram bem mantidos para os microtecidos individuais.
Todos os tecidos da miniarticulação foram coletados para análise de fenótipos após 28 dias de cultivo. O componente ósseo dos microtecidos das unidades osteocondrais expressou altos níveis de osteocalcina. Na porção cartilaginosa do osteocondral, os tecidos expressaram níveis significativamente elevados de colágeno tipo dois e agrecan.
Os níveis de expressão dos genes adipogênicos representativos, adiponectina e leptina, foram maiores no tecido adiposo. A deposição de minerais cálcio, fosfatase alcalina e proteína osteocalcina foi observada principalmente no tamanho ósseo dos microtecidos osteocondrais. O lado cartilaginoso dos tecidos osteocondrais apresentou glicosaminoglicanos e colágeno tipo dois bem retidos.
A expressão dos marcadores associados à hipertrofia de condrócitos, colágeno tipo 10 e ouriço indiano, foi significativamente diminuída após 28 dias de cultura. Deposição abundante de gotículas lipídicas foi encontrada no tecido adiposo. A coloração por imunofluorescência mostrou expressão robusta de lubricina e caderina 11 pelo TFS após quatro semanas de cultura.
Em um modelo de doença, o tratamento com IL um beta resultou em apoptose celular e níveis elevados de MMP-13 no TFS. A degradação da cartilagem foi tratada com IL um beta, sugerindo a ocorrência de crosstalk entre os tecidos osteocondrais e o TFS. A eficácia terapêutica do naproxeno através da administração sistêmica mostrou redução da degradação da cartilagem na IL uma beta miniarticulação.
A PCR em tempo real indicou que as quatro drogas modificadoras da doença potencialmente modificadoras da osteoartrite reverteram parcialmente a perda de cartilagem. As etapas mais importantes deste procedimento incluem a reticulação dos géis nas pastilhas e a colocação da pastilha no biorreator. O chip permite investigar a contribuição de outros fatores de risco oferecidos na osteoartrite, como obesidade e lesão mecânica.
Ele também pode ser usado para estudar outras doenças articulares.
