Aqui apresentamos protocolos para a cultura de células ósseas dentro de uma plataforma adaptável de laboratório em um chip. Essas técnicas podem ser usadas para aprofundar nossa compreensão dos mecanismos que regulam a remodelação óssea induzida mecanicamente. Nosso sistema permite a cultivo a longo prazo de células ósseas, o que permite quantificação direta da formação óssea e resorção em resposta a ambientes de carregamento mecânico alterados.
O uso dessas técnicas fundamentais pode levar a descobertas que se estendem a uma série de questões relacionadas com os ossos, como osteoporose, cicatrização de fraturas e osteolise periprotética. Para criar a camada de poço e microcanal, combine o prepolímero PDMS e o agente de cura a uma proporção de 10 para um em um copo plástico e misture vigorosamente, em seguida, desgas o polímero por 30 minutos. Despeje lentamente a mistura sobre a máscara pré-nivelada apropriada.
Deixe descansar por 30 minutos e asse a 45 graus Celsius por 18 horas. Solte as bordas do PDMS com uma espátula de laboratório afilada e retire-a cuidadosamente da máscara, em seguida, corte chips individuais com um bisturi e um modelo impresso em 3D e limpe-os com fita de embalagem. Para fazer a camada de membrana PDMS, repita as etapas anteriores para misturar, derramar e assar o PDMS.
Remova a folha PDMS da caixa de nivelamento e corte membranas individuais que correspondam às dimensões do poço e da camada microcanal. Use pinças para medir a espessura da membrana no centro e descartar quaisquer membranas que estejam fora da espessura desejada, em seguida, limpe cuidadosamente as membranas com fita de embalagem e coloque-as em um pedaço de filme de parafina. Para fazer a camada de tampa PDMS, repita as etapas anteriores para misturar, derramar e assar o PDMS.
Depois de cortar tampas individuais ao tamanho, faça furos de acesso através do PDMS com um soco de biópsia de um milímetro e, em seguida, limpe-as com fita de embalagem. Ative as superfícies das camadas um e dois com um limpador de plasma por 30 segundos em uma configuração de energia de radiofrequência média, em seguida, alinhe os orifícios de acesso na camada um com os microcanais na camada dois e pressione firmemente as duas camadas juntas. Para o design do poço profundo, repita este processo com as camadas dois e três usando fita dupla face para anexar o filme de parafina da camada três a uma superfície plana durante o tratamento plasmá-plasmápico.
Corte o excesso de material da membrana PDMS e retire cuidadosamente a folha de filme de parafina da parte inferior do chip. Asse o chip a 65 graus Celsius por 10 minutos para aumentar a força de ligação entre as camadas do PDMS, em seguida, insira pontas de distribuição de ângulo nos orifícios de acesso na tampa e fixá-los com um epóxi de duas partes usando uma ponta de micropipette para aplicar o epóxi em cada ponta. Depois que o epóxi tiver totalmente curado, limpe a superfície do chip com 70% de etanol e transfira-o para um armário de biossegurança.
Conecte uma seringa de cinco mililitros às pontas de distribuição com tubos de silicone estéreis e encha todo o chip com 70% de etanol por pelo menos 30 segundos. Retire o etanol do chip e esterilize-o com luz UV durante a noite. No dia seguinte, lave o chip três vezes com água destilada, encha-o com água e retire a tubulação das pontas de distribuição.
Incubar o chip por pelo menos 48 horas a 37 graus Celsius. Coloque uma mola de compressão ao redor do eixo da placa e insira-a no orifício central na parte inferior da base, em seguida, conecte o bloco de discagem à parte inferior da base com quatro parafusos auto-bater. Coloque uma segunda mola de compressão ao redor do parafuso central.
Insira o parafuso no orifício em forma de hexagonal na parte inferior do mostrador e enrosque o conjunto no orifício roscado no centro do bloco de discagem. Dane-se quatro impasses entre homens e mulheres na parte inferior da base. Remova a folga do dispositivo girando o mostrador no sentido anti-horário até que a parte superior da placa esteja abaixo da parte superior da base, depois gire lentamente o mostrador no sentido horário até que a parte superior da placa esteja nivelada com a parte superior da base.
Use uma seringa de cinco mililitros para remover a água do chip de poço profundo e revestir o fundo do poço com 200 microliters de colágeno tipo I em ácido acético por uma hora. Enxágüe o chip três vezes usando DPBS com cálcio e magnésio e coloque-o no suporte do chip. Semente o chip com osteocitos MLO-Y4 no mem médio alfa suplementado com soro de bezerro, FBS, e penicilina/estreptomicina.
Retire a tubulação das pontas de distribuição, coloque o chip em um prato de cultura de poço profundo e incuba as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Após a incubação, conecte tubos estéreis a pontas de distribuição e use uma seringa de cinco mililitros para remover o meio de cultura gasto do chip, em seguida, reabastecer lentamente o chip com meio fresco. Coloque o suporte do chip no conjunto retangular na parte superior da base do dispositivo de carga, alimente o tubo através das ranhuras localizadas na tampa e fixe a tampa na base.
Aplique carga nas células girando o mostrador no sentido horário até que o deslocamento de chapa desejado seja atingido, em seguida, coloque o dispositivo de carregamento em uma caixa de ponta de micropipette P1000 vazia e incubar as células com a carga por 15 minutos. Após a incubação, remova a carga das células girando o mostrador no sentido anti-horário para a posição inicial original, em seguida, remova a tampa do dispositivo, coloque o suporte do chip na placa de cultura de poço profundo e incuba as células para um período de recuperação pós-carga de 90 minutos. Use uma seringa de cinco mililitros para remover o meio condicionado do chip e remova o chip do suporte do chip, em seguida, use uma espátula afilada para quebrar o vínculo entre a tampa PDMS e a camada do poço.
As células estão prontas para serem analisadas. A configuração de poços rasos pode ser usada para analisar a atividade funcional de osteoblastos e osteoclartos. A formação óssea a partir de preosteoblastas foi quantificada usando manchas vermelhas de alizarina e von Kossa.
A resorção óssea dos osteoclastas foi quantificada usando a coloração azul toluidina e a microscopia eletrônica de varredura foi usada para verificar a presença de poços de resorção. A configuração do chip de poço profundo foi usada para induzir a mecanotransdução de osteocitos, esticando as células através de uma distensão estática fora do plano. Imagens de semeados de osteocito em chips demonstram que a incubação de 48 horas do chip com água destilada é fundamental para manter a viabilidade celular na morfologia típica.
Durante os ataques de carga, os osteocitos foram expostos a um gradiente de cepa induzido na membrana PDMS. A relação entre cepa equivalente média e deslocamento de chapas para valores entre um e dois milímetros foi determinada e um mapa de calor representativo da cepa induzida foi gerado. Após o carregamento, a viabilidade celular foi analisada com coloração de desidrogenase de lactato e o ensaio de células anexadas V e células mortas.
A mancha de desidrogenase de lactato de osteocitos esticados mostrou uma mancha mais leve perto da borda externa do poço, o que corresponde à localização de valores mais elevados de tensão. Nossa plataforma fornece um alto grau de versatilidade e pode ser usada para investigar uma variedade de fatores que regulam a remodelação óssea, como mecanotransdução induzida por carga, inflamação e efeitos medicamentosos. As técnicas aqui apresentadas fornecem uma base para o desenvolvimento de um verdadeiro órgão ósseo em um chip que poderia melhorar muito nossa compreensão das complexidades multicelulares que regulam a saúde óssea.
