Agradecemos ao Dr. Evan Jellison e à Sra. Li Zhu no núcleo de citometria de fluxo da UConn Health por sua assistência com a citometria de fluxo, à Dra. Lynn Puddington no Departamento de Imunologia da UConn Health por seu apoio aos instrumentos, à Sra. Slawa Gajewska e ao Dr. Paul Appleton no núcleo de pesquisa clínica da UConn Health por sua ajuda na obtenção de amostras de sangue. Agradecemos ao Dr. Christopher "Kit" Bonin e ao Dr. Geneva Hargis da UConn School of Medicine por sua ajuda com a redação científica e edição deste manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), EUA, um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira da American Heart Association (18CDA34110426) e um fundo de startups da UConn Health. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Amostras de sangue total heparinizadas foram obtidas de doadores humanos saudáveis não identificados após a obtenção do consentimento informado, conforme aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UConn Health, seguindo os princípios da Declaração de Helsinque. Todos os doadores assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os critérios de inclusão/exclusão deste estudo foram cuidadosamente desenvolvidos para garantir a adequação dos participantes e minimizar potenciais riscos. Os participantes elegíveis tinham idade entre 18 e 65 anos, de qualquer etnia, fluentes na língua inglesa e capazes de fornecer consentimento informado. Os participantes excluídos incluíram aqueles incapazes de fornecer consentimento informado para si mesmos, tais como aqueles que exigem um representante legalmente autorizado, indivíduos com menos de 18 anos ou mais de 65 anos, indivíduos encarcerados e mulheres grávidas. Além disso, os participantes tinham que estar livres do uso de medicamentos anti-inflamatórios e condições inflamatórias. Infecções atuais ou condições inflamatórias crônicas ou agudas em curso também foram critérios de exclusão. Finalmente, os indivíduos com uma história actual ou recente da infecção COVID-19 eram inelegíveis para o estudo. Esses critérios foram elaborados para garantir a segurança e adequação dos participantes, minimizando potenciais fatores de confusão que poderiam impactar os resultados do estudo.
1. Preparação dos reagentes
<ol><li>Meio neutrófilo: Preparar o meio neutrófilo adicionando albumina sérica humana a 2% ao RPMI-1640 sem vermelho de fenol (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Solução de fMLP: Prepare a solução de fMLP diluindo-a 100 vezes a partir da solução de armazenamento de dimetilsulfóxido de fMLP (DMSO) de 10 mM (consulte Tabela de Materiais) com RPMI 1640 sem vermelho de fenol, resultando em uma solução de fMLP de 100 μM.</li>
	<li>Solução de anticorpos: Diluir 120 μL do anticorpo monoclonal conjugado com aloficocianina (APC) mAb24 (mAb24-APC) (ver Tabela de Materiais), que relata a conformação de alta afinidade da integrina β2, em 10 mL de meio neutrófilo, criando uma solução de 1,2 μg/mL de mAb24-APC.</li>
	<li>Biblioteca de compostos: Diluir a biblioteca de compostos inicial com uma concentração de 10 mM a 1 mM adicionando 5 μL da biblioteca de 10 mM (ver Tabela de Materiais) a 45 μL de DMSO em placas de 384 poços usando o manipulador de líquidos. Posteriormente, transfira 5 μL por poço da biblioteca composta de 1 mM para uma placa vazia de 384 poços usando o manipulador de líquidos.</li>
	<li>Conforme ilustrado na Figura 1, quatro colunas ( 1, 2, 23, 24) continham apenas DMSO, mas nenhum composto, servindo como controles positivo e negativo na triagem. Diluir ainda mais cada poço adicionando 45 μL de RPMI-1640 sem vermelho fenol, resultando em uma concentração final de 100 μM para todos os compostos.</li>
</ol>2. Isolamento de neutrófilos do sangue humano
<ol><li>Usando uma pipeta sorológica, coloque cuidadosamente 4 mL de sangue sobre 8 mL de um meio de gradiente de densidade comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) em um tubo centrífugo de 15 mL (Figura 2A).</li>
	<li>Centrifugar o sangue a 550 × g durante 30-50 minutos a 20 °C. Desacelerar o rotor gradualmente (fator de desaceleração de 1). NOTA: A separação bem sucedida dos neutrófilos (banda 2 na Figura 2B) das hemácias pode variar entre os doadores. Para a maioria dos doadores, uma centrifugação de 30 min é suficiente. No entanto, para alguns doadores, um adicional de 10-30 minutos de centrifugação pode ser necessário se a separação não for bem-sucedida (Figura 2C).</li>
	<li>Remova cuidadosamente o plasma (o líquido amarelo no topo) e as células mononucleares (a faixa turva superior; PBMC band na Figura 2B) utilizando uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Coletar neutrófilos da banda turva inferior (banda de neutrófilos na Figura 2B) e aproximadamente 3-4 mL abaixo do líquido claro em um tubo centrífugo de 15 mL contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Misture suavemente a suspensão de neutrófilos, invertendo-a 2-3 vezes.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão a 400 × g durante 10 min a 20 °C e, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante por decantação.</li>
	<li>Ressuspender suavemente o pellet com 5 mL de PBS e centrifuga-lo a 300 × g por 5 min a 20 °C.</li>
	<li>Remova o sobrenadante por decantação e elimine cuidadosamente qualquer sobrenadante residual ao redor da boca do tubo e na parede do tubo usando sucção a vácuo. Ressuspender o pellet em 1 mL de meio neutrófilo.</li>
	<li>Conte os números celulares usando um hemocitômetro. Tipicamente, 1 a 4 × 107 neutrófilos foram obtidos a partir de 8 mL de sangue humano. NOTA: Pode haver contaminação de hemácias na suspensão de neutrófilos. As hemácias não afetam significativamente a maioria dos ensaios e podem prevenir a ativação/priming neutrofílico27. As hemácias precisam ser lisadas antes da contagem para obter uma concentração precisa de neutrófilos. Adicionar 10 μL da suspensão celular a 891 μL de água deionizada por 10-30 s para lisar as hemácias, em seguida, adicionar 99 μL de 10× PBS para equilibrar a pressão osmótica, evitando a lise dos neutrófilos.</li>
	<li>Ajustar a densidade celular para 6,25 × 105 células/mL adicionando meio neutrófilo.</li>
</ol>3. Preparação da placa de 384 poços
<ol><li>Em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, combinar 1 mL da solução de anticorpos (1,2 μg/mL mAb24-APC) com 0,2 mL de meio neutrófilo para criar uma solução de 1 μg/mL de mAb24-APC. Em seguida, adicione 25 μL dessa mistura aos poços de controle negativo em uma placa de 384 poços (os poços azuis da Figura 1).</li>
	<li>Em um tubo de centrífuga de 15 mL, misturar 9 mL da solução de anticorpos com 21,6 μL da solução de fMLP (100 μM) e 1,7784 mL de meio neutrófilo para criar uma solução contendo 1 μg/mL de mAb24-APC e 200 nM de fMLP. Em seguida, adicione 25 μL dessa mistura aos poços de controle positivo e teste em uma placa de 384 poços (os poços vermelho e azul na Figura 1).</li>
	<li>Transfira 5 μL das soluções compostas de 100 μM da placa de biblioteca de compostos para a placa de 384 poços usando uma pipeta multicanal.</li>
	<li>Centrifugar o líquido durante 1 min a 500 × g, à temperatura ambiente. NOTA: Para centrifugar placas, é necessário um rotor de caçamba oscilante e caçambas de placa.</li>
</ol>4. Tratamento de células
<ol><li>Adicionar 20 μL da suspensão de neutrófilos a cada poço usando uma pipeta de 16 canais (faixa de 5-50 μL, para cada coluna da placa de 384 poços). Misture suavemente 5-10 vezes usando a pipeta, mantendo um intervalo de tempo consistente entre cada pipetagem. NOTA: As concentrações finais nos poços são as seguintes: neutrófilos 2,5 × 105 células/mL (todos os poços); mAb24-APC 0,5 μg/mL (todos os poços); fMLP 100 nM (poços de controle positivo e teste); compostos de 10 μM (poços de teste).</li>
	<li>Incubar a placa num agitador a 300 rpm, à temperatura ambiente (TR), durante 10 min.</li>
	<li>Fixar as células adicionando 3 μL de paraformaldeído (PFA) a 16% em cada poço usando uma pipeta de 16 canais (concentração final de PFA ~0,91%). Em seguida, incube no gelo por 10 min. NOTA: Recomenda-se manter um intervalo de tempo consistente entre colunas diferentes ao adicionar neutrófilos e PFA. Isso garante que os neutrófilos em cada poço tenham o mesmo tempo de incubação com fMLP e mAb24-APC.</li>
</ol>5. Citometria de fluxo
<ol><li>Ligue o citômetro de fluxo (consulte Tabela de Materiais) e verifique se o computador conectado ao instrumento também está ligado.</li>
	<li>Certifique-se de que o recipiente de fluido de bainha esteja cheio e que o recipiente de resíduos esteja vazio e devidamente conectado ao instrumento.</li>
	<li>Coloque a placa de 384 poços no carregador de amostras do citômetro de fluxo. Certifique-se de que o poço A1 da placa esteja alinhado com a marca A1 na carregadeira.</li>
	<li>Abra o software e crie um novo experimento. Selecione bem 384 e escolha os fluoróforos desejados. Em seguida, clique em Configuração da placa, arraste para selecionar todos os poços e, em seguida, clique em Amostra. Ative a opção "Alta taxa de transferência" e selecione Alta no painel de taxas.<ol><li>Na caixa de volume, digite 50. Selecione amostras em colunas ímpares e, em seguida, ative a opção "Agitação". Finalmente, nomeie os exemplos no painel direito.</li>
	</ol></li>
	<li>Clique em Plot e gate. Em seguida, clique no botão Aplicar (duas setas em um círculo preenchido com verde) e, posteriormente, clique no botão de reprodução (forma de triângulo). Aguarde alguns segundos para observar algumas células do primeiro poço e, em seguida, clique no botão de pausa .<ol><li>Ajuste as tensões FSC e SSC para garantir a visualização adequada das células no gráfico. Clique em Aquisição e, em seguida, clique no botão play (forma de triângulo) para iniciar o ensaio.</li>
	</ol></li>
	<li>O citômetro de fluxo coletará sequencialmente ~50 μL de 1000-3000 neutrófilos de cada poço. Levará aproximadamente 3 h para completar toda a placa de 384 poços.</li>
	<li>Depois de concluir todos os exemplos, exporte os arquivos .fcs para a próxima etapa.</li>
</ol>6. Análise dos dados
<ol><li>Abra o software de análise de dados de citometria de fluxo (consulte Tabela de Materiais). Selecione e arraste a pasta que contém todos os arquivos .fcs para a janela do software e, em seguida, solte para importar os dados para o software.</li>
	<li>Clique duas vezes em uma amostra, com base em FSC e SSC28,29,30 na janela pop-up, como mostra a Figura 3. Selecione as linhas fechadas e arraste-as para a pasta e, em seguida, solte para aplicar o limite a todas as amostras nessa pasta.</li>
	<li>Calcule e exporte a intensidade de fluorescência mediana (MFI) APC de neutrófilos de cada poço usando a função de editor de tabelas do software. Clique em Adicionar coluna na guia Editar . Selecione Mediana na guia Estatística , escolha os neutrófilos da população fechada e selecione APC como parâmetro. Clique no botão OK .</li>
	<li>Retorne à guia "Editor de tabela", selecione Todas as amostras na guia "Grupo" e pressione o botão Criar tabela . Uma nova janela aparecerá exibindo a tabela criada. Salve-o como um arquivo de texto, CSV ou Excel.</li>
	<li>Abra a tabela exportada, calcule o valor médio e o desvio padrão da IFM APC para as amostras controle positivo e negativo (Figura 4).</li>
	<li>Calcule o fator Z (Z') da placa usando a equação: Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), onde σ p e σ n são os desvios-padrão dos controles positivo e negativo, respectivamente, e μp e μn são as médias dos controles positivo e negativo, respectivamente31. NOTA: O fator Z' indica a separação das distribuições de controle positivo e negativo. Um Z' de 0 significa nenhuma separação, enquanto um Z' de 0,5 indica separação igual. Como mencionado em um estudo anterior31, Z' > 0,5 indica um excelente ensaio para triagem de compostos. Um Z' na faixa de 0,5 a 0 é aceitável, mas pode identificar apenas acertos fortes no ensaio, o que exigirá validação adicional em ensaios secundários.</li>
	<li>Considerar compostos como "acertos" para triagem quando a IFM APC de neutrófilos tratados com compostos for menor que três vezes o desvio padrão da MFI de controle positivo subtraída da MFI de controle positivo (P = 0,0013, representada pela linha pontilhada na Figura 4).</li>
</ol>

Triagem de inibidores de ativação da integrina β2 em neutrófilos humanos

<ol>
	<li>Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular &#38; Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).</li>
	<li>Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).</li>
	<li>Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology &#38; Therapeutics. 147, 123-135 (2015).</li>
	<li>Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).</li>
	<li>Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).</li>
	<li>Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).</li>
	<li>Sariba&#351;, A. S., &#214;zdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).</li>
	<li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).</li>
	<li>Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Kr&#228;henb&#252;hl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-&#945;L&#946;2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).</li>
	<li>Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin &#945;5&#946;1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).</li>
	<li>Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).</li>
	<li>Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).</li>
	<li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).</li>
	<li>Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent &#946;2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
	<li>Fan, Z. et al. High-affinity bent &#946;2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).</li>
	<li>Gupta, V. et al. The &#946;-tail domain (&#946;TD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).</li>
	<li>Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, &#945;X&#946;2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).</li>
	<li>Sun, H., Hu, L., Fan, Z. &#946;2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).</li>
	<li>Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of &#946;2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).</li>
	<li>Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the &#946;2 subunit I domain in regulation of integrin &#945;L&#946;2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).</li>
	<li>Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin &#945;L&#946;2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).</li>
	<li>Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin &#946;-subunit I-like domains by one-turn C-terminal &#945;-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).</li>
	<li>Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).</li>
	<li>Torres, M., Hall, F., O&#39;neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).</li>
	<li>Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).</li>
	<li>Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).</li>
	<li>Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).</li>
	<li>Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).</li>
	<li>Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).</li>
	<li>Blanco-Camarillo, C., Alem&#225;n, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).</li>
	<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
	<li>Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the &#946;2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).</li>
	<li>Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and &#946;2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5&#8242;-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).</li>
	<li>Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).</li>
	<li>Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin &#946;2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).</li>
	<li>Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).</li>
	<li>Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).</li>
	<li>Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).</li>
	<li>Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
	<li>Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel &#946;1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).</li>
	<li>Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common &#946;1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).</li>
	<li>Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-&#946;1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).</li>
	<li>Spiess, M. et al. Active and inactive &#946;1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).</li>
	<li>Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin &#945;5&#946;1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).</li>
	<li>Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).</li>
	<li>Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).</li>
	<li>Carre&#241;o, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).</li>
	<li>Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).</li>
	<li>Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).</li>
	<li>van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).</li>
	<li>Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).</li>
	<li>Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).</li>
	<li>Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).</li>
	<li>Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, &#945;4&#946;1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).</li>
	<li>Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).</li>
	<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.

O início e o término da estimulação e coloração de neutrófilos são determinados pela adição de neutrófilos e do PFA fixador. Portanto, garantir o mesmo intervalo de tempo entre a pipetagem de neutrófilos ou PFA em cada coluna é fundamental. Isso garante que o tempo de estimulação e coloração dos neutrófilos de cada poço permaneça consistente. Devido ao curto tempo de vida dos neutrófilos, todo o experimento, desde a coleta de sangue de doadores até a conclusão da citometria de fluxo, deve ser reali...

Muitas doenças inflamatórias são caracterizadas pela infiltração de neutrófilos no local do edema ou lesão1. Para infiltração desses tecidos, os neutrófilos devem completar a cascata de recrutamento de neutrófilos, que envolve parada no endotélio, extravasamento através da parede do vaso e recrutamento para o tecido2. Os neutrófilos circulantes necessitam da ativação da integrina β2 para completar essa cascata, especialmente para a fase de parada. Assim, drogas inibidoras de integrinas que reduzem a adesão, o extravasamento e o recrutamento de neutrófilos podem efetivamente tratar doenças inflamatórias 3,4.
As integrinas β2 já foram alvo de doenças inflamatórias anteriormente. O efalizumabe, um anticorpo monoclonal que tem como alvo direto a integrina αLβ2, foi desenvolvido para o tratamento da psoríase5. Entretanto, o efalizumabe foi suspenso devido ao seu efeito colateral letal - leucoencefalopatia multifocal progressiva resultante da reativação do vírus JC 6,7. Novas terapias anti-inflamatórias baseadas em integrinas devem considerar a manutenção das funções anti-infecciosas dos leucócitos para minimizar os efeitos colaterais. Os efeitos colaterais do efalizumabe podem ser devidos à circulação prolongada de anticorpos monoclonais na corrente sanguínea, o que poderia inibir as funções imunes em longo prazo8. Um estudo recente mostra que o efalizumabe medeia ligações cruzadas αLβ2 e a internalização indesejada de integrinas α4, fornecendo uma explicação alternativa para os efeitos colaterais9. Assim, antagonistas de pequenas moléculas de curta duração poderiam evitar esse problema.
Um método de alto rendimento para triagem de antagonistas de integrinas β2 de pequenas moléculas usando neutrófilos humanos é apresentado aqui. A ativação da integrina β2 requer mudanças conformacionais do ectodomínio da integrina para obter acesso e aumentar sua afinidade de ligação ao seu ligante. No modelo canônico de switchblade, o ectodomínio de integrina dobrado-fechado primeiro se estende a uma conformação estendida-fechada e, em seguida, abre seu cabeçote para uma conformação estendida-aberta totalmente ativada10,11,12,13. Há também uma via alternativa que parte do dobrado-fechado para o dobrado-aberto e estendido-aberto, eventualmente 14,15,16,17,18,19. O anticorpo conformação-específico mAb24 liga-se a um epítopo no domínio β2-I-like humano quando a cabeça do ectodomínio está aberta20,21,22,23.
Aqui, mAb24-APC é usado para determinar se as integrinas β2 estão ativadas. Para ativar neutrófilos e integrinas, N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), um peptídeo quimiotático curto derivado de bactérias que pode ativar integrinas β2 de neutrófilos24, é usado como estímulo nesse protocolo. Quando fMLP se liga ao Fpr1 em neutrófilos, cascatas de sinalização a jusante envolvendo proteínas G, fosfolipase Cβ e γ de fosfoinositida 3-quinase são ativadas. Esses eventos de sinalização acabam resultando na ativação da integrina através da via de sinalização de dentro para fora18,25. Além de antagonistas de pequenas moléculas que se ligam diretamente às integrinas β2 e impedem mudanças conformacionais da ativação da integrina26, compostos que podem inibir componentes da via de sinalização de ativação de dentro para fora da integrina β2 também seriam detectados com este método. Os citômetros de fluxo automatizados permitem a triagem de alto rendimento. A identificação de novos antagonistas pode não apenas aprofundar nossa compreensão da fisiologia das integrinas, mas também fornecer informações translacionais sobre a terapia anti-inflamatória baseada em integrina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

Este protocolo visa estabelecer um método para identificar pequenos antagonistas moleculares da ativação de integrinas β2, utilizando anticorpos notificadores de mudança conformacional e citometria de fluxo de alto rendimento. O método também pode servir como um guia para outros métodos de triagem de alto rendimento baseados em anticorpos. As integrinas β2 são moléculas de adesão leucocitárias específicas que são cruciais na resposta imune. Os neutrófilos dependem da ativação da integrina para sair da corrente sanguínea, não apenas para combater infecções, mas também para estar envolvidos em múltiplas doenças inflamatórias. O controle da ativação das integrinas β2 apresenta uma abordagem viável para o tratamento de doenças inflamatórias associadas a neutrófilos. Nesse protocolo, um anticorpo monoclonal, mAb24, que se liga especificamente ao headpiece de alta afinidade das integrinas β2, é utilizado para quantificar a ativação da integrina β2 em neutrófilos humanos primários isolados. N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) é usado como um estímulo para ativar integrinas β2 neutrófilos. Um citômetro de fluxo de alto rendimento capaz de executar automaticamente amostras de placas de 384 poços foi usado neste estudo. Os efeitos de 320 produtos químicos na inibição da integrina β2 são avaliados dentro de 3 h. Moléculas que têm como alvo direto integrinas β2 ou moléculas-alvo na via de sinalização de ativação de dentro para fora da integrina iniciada pelo receptor acoplado à proteína G podem ser identificadas através desta abordagem.

Dados de uma triagem representativa de placas de 384 poços (Figura 4) revelaram que os controles negativos tinham uma MFI de mAb24-APC de 3236 ± 110, enquanto os controles positivos tinham uma MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. O fator Z' para esta placa é de aproximadamente 0,33, que está dentro de uma faixa aceitável31. No entanto, Z' requer validação adicional em ensaios secundários.
Para normalizar os dados, todos os valores foram...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of Î²2 Integrin Activation at JoVE.com

Autor em destaque: Desenvolvimento de um método para identificar pequenos antagonistas moleculares da ativação da integrina β2 

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Nossa pesquisa está focada na integrina neutrofílica, e neste estudo pretendemos estabelecer um método para encontrar pequenos antagonistas moleculares da ativação da integrina Beta-2. Acreditamos que com este método podemos encontrar novos antagonistas que podem aprofundar nossa compreensão na fisiologia das integrinas, e também fornecer informações translacionais sobre a terapia anti-inflamatória baseada em integrina. No futuro, nos concentraremos na descoberta de novos anti-inflamatórios e na dissecação de seus mecanismos de ação.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.1K visualizações.  UConn Health. Nossa pesquisa está focada na integrina neutrofílica, e neste estudo pretendemos estabelecer um método para encontrar pequenos antagonistas moleculares da ativação da integrina Beta-2. Acreditamos que com este método podemos encontrar novos antagonistas que podem aprofundar nossa compreensão na fisiologia das integrinas, e também fornecer informações translacionais sobre a terapia anti-inflamatória baseada em integrina. No futuro, nos concentraremos na descoberta de novos anti-infl...

Vídeo: Autor em destaque: Desenvolvimento de um método para identificar pequenos antagonistas moleculares da ativação da integrina β2 

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Imunologia e Infecção

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...