Agradecemos ao Dr. Yves L. Janin por seus comentários e sugestões proveitosas. Gostaríamos de agradecer a HH Gad para CHIK / Ren e C. Combredet pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Pasteur, o Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), o Institut Carnot - Pasteur Maladies Infecciosas (STING Programa de POV e HM- L), a Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programa de STING 2,0 a POV), eo &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Chemical Projeto Biblioteca, bolsas n ° 06-222 I / R e I 09-1739 / R para HM-L.). O trabalho sobre CHIKV / Ren foi apoiada pelos ArbOAS projeto (concessão ANR 2010-INTB-1601-02).

1. Preparação de placas de 96 poços com filha Compostos <ol><li> Mover placas mãe de 96 cavidades que contêm soluções-mãe 10 mM de compostos químicos em DMSO a partir de -20 ° C até à temperatura ambiente. Diluir 5x compostos em DMSO para se obter placas de intermediários de diluição de 96 poços a 2 mM. A diluição é obtida por pipetagem de 5 ul em 20 ul de DMSO e a mistura. </li><li> Pipete 1 mL de diluição em placas de poços de branco seco, de cultura de tecidos de código de barras placas de 96 poços. Este primeiro conjunto de placas filhas (D1) vai ser utilizado para avaliar a toxicidade dos compostos a uma concentração final de 20 uM. Armazenar as placas filhas a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Dilui-se novamente 1:10 compostos por pipetagem de 4 ul de diluição em placas de 36 ul de DMSO e mistura. Pipetar 1 mL em poços secos de branco, fundo plano, cultura de tecidos com código de barras de 96 poços placas. Este segundo conjunto de placas filhas (D2) vai ser utilizado para avaliar a inibição da MV replication pelos compostos a uma concentração final de 2 fiM. Armazenar as placas filhas a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 2. Preparação de culturas de células para determinar a toxicidade do composto <ol><li> Cultivar células HEK-293T, a 37 ° C e 5% de CO 2 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com estabilizado L-glutamina e suplementadas com 10% soro fetal bovino (FCS), estreptomicina (100 ug / ml) e penicilina (100 IU / ml). As células são passadas por tripsinização a cada 4-5 dias, e diluído 1:10 em um frasco fresco. As células devem estar em fase de registro para experimentos. </li><li> No dia da experiência, recuperar células por tripsinização e efectuar a contagem celular. Células por centrifugação, e ressuspender-los em 3 x 10 5 células / ml em meio de cultura. Considere-se que 12,5 ml de suspensão de células são necessárias para cada placa de triagem. </li><li> Transferência de células para uma calha, e dispensar 100 ml de suspensão de células em placas D1 contendo componente químico cravadounds. A suspensão de células no interior da calha é agitado periodicamente para evitar a sedimentação. </li><li> Pico de controle de poços A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 e G12 com 1 ml de DMSO. Poços correspondentes serão utilizados como referência para as células vivas (sem toxicidade). Pico de controlo poços B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 e H12 com 1 ml de DMSO e 2,5 mL de uma solução a 0,5% de IGEPAL para matar as células. Poços correspondentes serão usadas como referência para as células mortas (alta toxicidade). </li><li> Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3. Preparação de culturas de células infectadas por rMV2/Luc <ol><li> Crescer e recuperar as células, tal como descrito em 2.1 e 2.2. Mais uma vez, as células ressuspender em 3 x 10 5 células / ml em meio de cultura. Considere-se que 12,5 ml de suspensão de células são necessárias para cada placa de triagem. </li><li> Opcional: meio de cultura suplemento com uridina a 20 mg / ml. Nota: Quando o rastreio de bibliotecas químicos para replicatio viraln inibidores, parece que os compostos de segmentação etapas precoces da via de biossíntese de pirimidina são frequentemente isolados 13,16,27,28. A adição de uridina para o meio de cultura é usada para filtrar estas moléculas antivirais. Com efeito, esta repõe eficientemente a replicação viral quando as enzimas a montante da via de biossíntese de pirimidina estão bloqueados. </li><li> Salve 01:10 de suspensão de células para poços de controlo com células não infectadas, e vá para a infecção com o volume restante. </li><li> Descongelar o volume apropriado de solução de estoque rMV2/Luc. Soluções estoque de MT são geralmente em 10 -10 6 8 partículas infecciosas por ml. A cultura deve ser infectado com 0,1 partículas infecciosas de rMV2/Luc por células alvo, o que corresponde a 0,1 multiplicidade de infecção (MOI). Nota: rMV2/Luc é derivado de vacina MV (cepa Schwarz) e é manipulada de um ambiente de BSL2. </li><li> Adicione o vírus a suspensão de células e misture delicadamente. Transferência de células infectadas para uma calha, e dispensar 100mL de suspensão de células infectadas em colunas de 2 a 11 de placas D2 contendo compostos químicos perfurantes. Suspensão celular dentro da calha é regularmente misturado delicadamente. </li><li> Nas colunas 1 e 12, dispensar 100 ul de células não-infectadas, bem em um dois. As células infectadas são dispensados ​​nos demais poços. </li><li> Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 4. Medidas de luciferase de atividade e de Análise de Dados <ol><li> Retirar as placas do incubador D1, e determinar a viabilidade celular através da adição de 50 ul de reagente de viabilidade baseados em luciferase directamente aos poços de cultura. Misturar e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. Ler as placas com um luminómetro. O tempo de integração é de 100 ms por bem. </li><li> Retirar as placas do incubador D2, e determinar a actividade de luciferase por adição de 50 ul de substrato de luciferase directamente aos poços de cultura. Incubar durante 6 minutos à temperatura ambiente, e ler as placas com um luminómetro, como descricama acima. </li><li> Calcular um factor-Z&#39;para cada placa D1 do ensaio de toxicidade para garantir a qualidade da tela 29. Z &#39;= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), onde μ + e + σ correspondem aos meios de luminescência e desvios-padrão para as células HEK-293T com DMSO sozinho (sem toxicidade), e μ e σ-são meios de luminescência e desvios padrão para poços de cultura tratados com IGEPAL para matar as células. Z &#39;está prevista para ser superior a 0,5, ou a correspondente placa é descartado. </li><li> Definir limite de toxicidade em μ + / 2. Descarte compostos com valores de luminescência abaixo deste ponto de corte (Figura 3A). </li><li> Calcular um factor-Z&#39;para cada placa D2 do ensaio anti-viral. Aqui, μ + e + σ correspondem aos meios de luminescência e desvios-padrão para as células infectadas cultivadas com DMSO sozinho, e μ e σ-são meios de luminescência e desvios-padrão para as células não-infectadas. Mais uma vez, placas com Z &amp; #39; Os valores abaixo de 0,5 são descartados. </li><li> Calcula-se a inibição da replicação do vírus da seguinte forma: percentagem de inibição = (μ + - a actividade da luciferase para o composto X) / (μ + - μ-) * 100. Definir limite de inibição em 75%, e selecionar os compostos que reduzam os valores de luminescência abaixo desse ponto de corte (Figura 3B) e não são tóxicos, segundo critérios descritos em 4.4. </li></ol> 5. Tela secundária para toxicidade e amplo espectro antiviral Atividade <ol><li> Fazer diluições em série 1:02 para cada batida composto em DMSO, a partir de 500 uM a 4 uM (8 diluições). Encha branco, placas de cultura de tecidos com código de barras, com 50 ul de meio de cultura. Adicionar 1 ml de cada diluição do composto em poços de cultura. Repita duas vezes para 3 placas de cultura com as diluições em série em duplicado para cada composto de acerto. </li><li> Prepare a 37,5 ml de uma suspensão de células HEK-293T em 6 x 10 5 células / ml em meio de cultura, tal como descrito acima (em 2.1 e 20,2). Dispensar 2x 12,5 ml em tubos falcon e infectar as células com qualquer rMV2/Luc no MOI = 0,1 ou CHIKV recombinante expressando Renilla luciferase (CHIKV / Ren) em MOI = 0,2. Misture por inversão. Nota: CHIKV / Ren é derivado de uma estirpe de tipo selvagem de CHIKV e, portanto, devem ser manipulados em um ambiente BSL3. As placas podem ser movidos a partir de BSL3 para BSL1 vez de substrato de Renilla foi adicionado aos poços de cultura (ver abaixo). </li><li> Dispense 50 ul de células não infectadas, rMV2/Luc-infected ou CHIKV / Ren-infectadas em placas de cultura contendo diluições em série de compostos de sucesso. Incubar 24 horas a 37 ° C. </li><li> Adicionar 50 ul de substrato de luciferase do pirilampo para determinar a actividade da luciferase do pirilampo nas cavidades rMV2/Luc-infected. Adicionar 50 mL de substrato Renilla luciferase para determinar a atividade da luciferase Renilla em CHIKV / poços Ren-infectados. Finalmente, adicionar 50 ul de reagente de ensaio de viabilidade baseados em luciferase para células não infectadas para determinar a viabilidade celular. </li><li> Dados de plotagem (Figura 4) e determinar as concentrações de compostos que inibem o bater MV e replicação CHIKV por 50%. Ignorar composto mostrando alguma toxicidade neste ensaio. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O gasoduto triagem descrito aqui tem como objectivo seleccionar compostos com um perfil adequado como inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Quando uma biblioteca de 10.000 compostos foi exibido com este protocolo e critérios de filtragem acima referidos foram aplicados, ou seja, a inibição da replicação MV superior a 75%, 40 compostos (0,4%) resultados positivos. Além disso, cerca de metade deles mostraram alguma toxicidade no ensaio de viabilidade com base em luciferase, e foram desconsiderados por...

Vírus de RNA são responsáveis ​​por uma grande variedade de infecções humanas, e têm um enorme impacto sobre as populações de todo o mundo, tanto em termos de saúde pública e de custo econômico. Vacinas eficazes têm sido desenvolvidos contra diversos vírus de ARN humano, e são amplamente utilizados como tratamentos profiláticos. No entanto, ainda existe uma falta crítica de medicamentos terapêuticos contra infecções por vírus RNA. Na verdade, as vacinas não estão disponíveis eficientes contra as principais patógenos humanos, tais como o vírus da dengue, vírus da hepatite C ou vírus respiratório sincicial humano (HRSV). Além disso, os vírus de RNA são responsáveis ​​pela maioria das doenças emergentes, que aumentaram em freqüência por causa de trocas globais e impacto humano sobre sistemas ecológicos. Contra esta ameaça que representam os vírus de RNA, nosso arsenal terapêutico é extremamente limitado e relativamente ineficiente 1-3. As terapias atuais são, essencialmente, com base no tipo recombinante interferons I (IFN-α / β) para estimular a imunidade inata,ou a administração de ribavirina. Embora o modo de ação deste analógico ribonucleosido é controverso e, provavelmente, depende de vários mecanismos, a inibição da IMFDH celular (inosina monofosfato desidrogenase), que esgota intracelulares piscinas GTP, é claramente essencial 4. Ribavirina, em combinação com IFN-α peguilado, é o principal tratamento contra o vírus da hepatite C. No entanto, os tratamentos de IFN-α / β e ribavirina são de relativamente fraca eficácia in vivo contra a maioria dos vírus de ARN em que a sinalização eficiente romba IFN-α / β através da expressão da virulência 5 e frequentemente escapar ribavirina 3. Isso, somado ao fato de que a ribavirina está levantando questões importantes de toxicidade, embora tenha sido aprovado recentemente contra a doença hRSV grave com benefícios controversos 6. Mais recentemente, alguns tratamentos específicos do vírus têm sido comercializados, em particular contra o vírus influenza, com o desenvolvimento of inibidores da neuraminidase 3. No entanto, a grande diversidade e emergência permanente de vírus RNA impede o desenvolvimento de tratamentos específicos contra cada um deles em um futuro relativamente próximo. Ao todo, este sublinha a necessidade de estratégias eficientes para identificar e desenvolver moléculas antivirais potentes em um futuro próximo. É trivial para dizer que um inibidor de largo espectro activo contra um grande painel de vírus de ARN resolveria este problema. Embora tal molécula ainda é o sonho de um virologista, a nossa melhor compreensão dos mecanismos de defesa celular e sistema imune inato sugerem que algumas possibilidades existem 7,8. Vários laboratórios acadêmicos e industriais estão agora a procurar moléculas que estimulam facetas específicas de mecanismos de defesa celular ou vias metabólicas para diminuir a replicação viral. Embora tais compostos provavelmente mostram efeitos colaterais significativos, tratamentos contra infecções virais agudas serão administrared por um tempo relativamente curto, tornando-as aceitáveis, apesar de alguma toxicidade potencial no longo prazo. Várias estratégias têm sido desenvolvidos para identificar estas moléculas antivirais de largo espectro. Alguns programas de pesquisa visam encontrar moléculas que têm como alvo as vias de defesa ou metabólicas específicas. Isso inclui, por exemplo, receptores de reconhecimento de patógenos, para esclarecer a expressão do gene antiviral 9 e ativam fatores antivirais como RNaseL 10, máquinas autofagia para promover a degradação do vírus 11, a síntese de nucleosídeos vias 12,13, ou cascatas apoptóticos para precipitar a morte de células infectadas por vírus 14. Outros grupos têm desenvolvido telas fenotípicos que não são baseadas em alvo 13,15-17. Nesse caso, as moléculas antivirais são simplesmente identificados pela sua capacidade para bloquear a replicação do vírus em um determinado sistema celular. A suposição é de que em geral um composto inibidor de 2-3 vírus RNA não relacionadas que têm um perfil apropriado para um amplo spectrum molécula antiviral. O modo de acção dos compostos seleccionados de golpes com uma tal abordagem empírica é determinado apenas em um segundo tempo e, eventualmente, pode levar à identificação de novos alvos celulares para antivirais. Curiosamente, uma análise retrospectiva de novas drogas aprovadas pelo os EUA Food and Drug Administration, entre 1999 e 2008 mostrou que, em geral, esses exames fenotípicas tendem a ter melhor do que as abordagens por objectivo realizar a descobrir primeiro-in-class drogas de pequenas moléculas 18 . A replicação viral em ensaios baseados em células de alto rendimento geralmente é determinada a partir de efeitos citopáticos do vírus. As células são infectadas e cultivadas em 96 - ou placas de 384 poços na presença dos compostos testados. Depois de alguns dias, as camadas celulares são fixadas e coradas com corantes, tais como violeta de cristal. Finalmente, a absorvência é determinada com um leitor de placas e os compostos que inibem a replicação viral são identificados pela sua capacidade para preservar as camadas celulares from efeito citopático induzido pelo vírus. Alternativamente, os efeitos citopáticos mediados por vírus são avaliados utilizando ensaios de viabilidade de padrão, tais como a redução de MTS. Tais ensaios são altamente tratável e de baixo custo, mas sofrem de três grandes limitações. Primeiro, eles exigem uma combinação vírus-célula, onde a replicação viral é citopático em apenas alguns dias, mas nem sempre isso é possível, chamando, assim, para abordagens alternativas 19. Em segundo lugar, eles são mal quantitativa, uma vez que são baseados em uma medida indireta da replicação viral. Finalmente, os compostos tóxicos podem ser classificados como resultados positivos, e, portanto, deve ser eliminado, com um ecrã de contador que mede a viabilidade celular. Para ultrapassar algumas destas dificuldades, os vírus recombinantes, ou replicões foram projectadas por genética reversa para expressar proteínas repórter, tal como luciferase ou EGFP, a partir de uma unidade de transcrição adicional ou em grelha com genes de proteínas virais (alguns exemplos são 20-23). Quando estes vírus se replicar, pr repórteroteins são produzidos em conjunto com as proteínas virais próprios. Isto proporciona um ensaio muito quantitativa para medir a replicação viral e avaliar a actividade inibidora de moléculas candidatas. Isto é particularmente verdadeiro para os vírus recombinantes que exprimem a luciferase (ou outras enzimas capazes de bioluminescência) uma vez que este sistema repórter apresenta uma vasta gama dinâmica, com uma elevada sensibilidade e praticamente sem fundo. Além disso, não há uma fonte de luz de excitação, evitando assim a interferência com fluorescência composto 24. Aqui, detalhes de um protocolo de alto rendimento para a tela bibliotecas químicas para inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Os compostos são testados em células de seres humanos infectados com um vírus de sarampo recombinante (MV) que expressam a luciferase do pirilampo 25 (rMV2/Luc, Figura 1, a tela de primário). MV pertence Mononegavirales ordem, e é muitas vezes considerado como um membro protótipo de vírus RNA de cadeia negativaes. Como tal, MV genoma é utilizada como um modelo de polimerase viral para sintetizar moléculas de mRNA que codificam para as proteínas virais. Na estirpe recombinante denominado MV rMV2/Luc, a expressão da luciferase é expressa a partir de uma unidade de transcrição adicionais inseridos entre os genes P e M (Figura 2A). Em paralelo, os compostos são testados quanto à sua toxicidade em células humanas utilizando um reagente à base de luciferase comercial que avalia, por quantificação de ATP, o número de células metabolicamente activas na cultura (Figura 1, o ecrã primário). Bibliotecas químicas inteiras podem ser facilmente rastreados com estes dois ensaios, a fim de seleccionar os compostos que não são tóxicos e bloqueiam eficazmente a replicação MV. Em seguida, os hits são testados para a inibição de dose-resposta de replicação MV, a falta de toxicidade assim como quanto à sua capacidade para afectar o vírus Chikungunya (CHIKV) replicação (Figura 1, o ecrã secundário). CHIKV é um membro da família Togaviridae e seu genoma é apmolécula de RNA de fita simples ositive. Como tal, é completamente alheios ao sarampo e compostos que inibem tanto MV e CHIKV tem uma chance grande de inibir um grande painel de vírus RNA. Proteínas não estruturais são CHIKV directamente traduzido a partir do genoma viral, enquanto que as proteínas estruturais são codificadas através de transcrição e tradução de uma molécula de ARNm subgenómico. O nosso ensaio de replicação in vitro para CHIKV baseia-se uma estirpe recombinante denominado CHIKV / Ren, que expressa a enzima luciferase de Renilla como uma parte clivada da poliproteína não estrutural por meio de uma inserção do gene repórter entre NSP3 e NSP4 sequências de 26 (Figura 2B). A medida da atividade da luciferase Renilla permite o monitoramento da replicação viral na fase inicial do ciclo de vida CHIKV. Este protocolo de alto rendimento foi usada para identificar rapidamente os compostos com um perfil adequado para os antivirais de largo espectro de uma biblioteca comercial de 10.000 Molecules enriquecido pela diversidade química. Os compostos foram essencialmente seguinte regra de cinco de Lipinski, com pesos moleculares variando 250-600 daltons, e registrar valores de D abaixo de 5. Maioria dessas moléculas eram novas entidades químicas não disponíveis em outras bibliotecas comerciais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

Vírus de RNA são responsáveis ​​por importantes doenças humanas, tais como a gripe, bronquite, dengue, hepatite C ou sarampo. Eles também representam uma ameaça emergente devido ao aumento das trocas em todo o mundo e as populações humanas penetrantes ecossistemas mais e mais naturais. Um bom exemplo desse tipo de situação emergente é epidemias de vírus chikungunya de 2005-2006, no Oceano Índico. Avanços recentes em nossa compreensão de caminhos celulares que controlam a replicação viral sugerem que os compostos que visam funções da célula hospedeira, em vez de o próprio vírus, poderia inibir um grande painel de vírus RNA. Alguns compostos anti-virais de amplo espectro têm sido identificados com ensaios orientados-alvo do hospedeiro. No entanto, a medição da inibição da replicação do vírus em culturas de células utilizando a redução de efeitos citopáticos como uma leitura ainda representa uma estratégia de rastreio primordial. Esses rastreios funcionais foram significativamente melhoradas pelo desenvolvimento de vírus recombinantes que expressam as enzimas repórter cazes de bioluminescência, tais como a luciferase. No presente relatório, detalhamos um gasoduto high-throughput screening, que combina o sarampo recombinante e vírus chikungunya com ensaios de viabilidade celular, para identificar compostos com um perfil antiviral de amplo espectro.

Este gasoduto triagem depende em primeiro lugar na seleção de compostos que inibem a replicação do MV e não mostram qualquer toxicidade celular significativa (Figura 1, a tela principal). Aproveita-se os ensaios baseados em luciferase para determinar a toxicidade celular e a inibição da replicação viral. Todos os passos de pipetagem e de aquisição de dados pode ser realizada em um ambiente de alto rendimento com uma plataforma robótica. A toxicidade celular dos c...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K visualizações.  Institut Pasteur, CNRS UMR3569.  Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas. 

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Imunologia e Infecção

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocápside Annealing-Mediated Eletroforese (NAME) ensaio permite a identificação rápida de HIV-1 Nucleocápside Inibidores

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...