Este protocolo permite medir a capacidade dos anticorpos de opsonizar e induzir a fagocitose de eritrócitos infectados pelo plasmodium falciparum. Podem ser testados anticorpos presentes no soro de indivíduos naturalmente expostos à infecção por parasitas, bem como aqueles induzidos pela imunização com antígenos parasitas. Demonstrando o procedimento comigo estará Maiken Visti, um técnico do meu laboratório.
Para criar uma cultura celular THP-1 para um ensaio de fagocitose, um dia antes do experimento semeou as células em um frasco de cultura ao quadrado de 25 centímetros e uma concentração de 2,5 vezes 10 a 5 células por mililitro em THP um meio de cultura celular. No dia do experimento, pelo menos uma hora antes do bloco de experimentos para placas de fundo redondo de 96 poços com 150 microliters de FBS estéreis de 2%em PBS por poço. Para a colheita e purificação de eritrócitos infectados por trophozoitas em estágio médio e tardio em 10 mililitros de cultura parasita, com pelo menos 5% de parasitas e adicionar a uma coluna magnética.
Lave a coluna com 50 mililitros de cultura parasita. Para elutá-los os eritrócitos infectados, remova a coluna do ímã e lave-a com 50 mililitros de cultura parasita. Em seguida, colete os eritrócitos infectados por centrifugação e resuspende a pelota em um mililitro de meio de cultura parasita fresco para contar.
Ajuste a suspensão de eritrócito infectado purificado em 3,3 vezes 10 para a sétima célula por mililitro em meio de cultura parasita contendo brometo de etídio, para uma concentração final de 2,5 microgramas por mililitro. Em seguida, remova a solução de bloqueio de uma placa de 96 poços, jogando a placa em um recipiente de lixo. Em seguida, remova qualquer excesso sobre uma toalha de papel e adicione 30 microliters do rótulo de brometo de etídio infectado suspensão de eritrócito infectado a todos, exceto um bem na metade superior da placa.
Adicione 30 microliters de cultura parasita ao poço vazio e incubar a placa por 10 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Ao final da incubação, adicione 170 microlitadores de cultura parasita médio a cada poço e sedimente os eritrócitos infectados na parte inferior da placa por centrifugação. Remova o supernatante, jogando a placa em um recipiente de lixo, e lave os eritrócitos infectados com brometo de etídio mais duas vezes, com 200 microliters de cultura parasita por bem, como apenas demonstrado.
Após a segunda lavagem, use uma pipeta multicanal para remover cuidadosamente todo o volume de supernanato de cada poço, sem perturbar as pelotas. E resuspenja o eritrócito infectado rotulado por eritrócitos em 30 microliters de solução de anticorpos, incluindo os controles apropriados e amostras de teste previamente preparados em meio de cultura parasita. Em seguida, coloque a placa a 37 graus Celsius por 45 minutos, protegida da luz.
Enquanto os eritrócitos infectados estão sendo opsonizados, colete as células THP-1 por centrifugação, e resuspenda a pelota em 12 mililitros de meio de cultura celular THP-1 fresco e pré-aquecido. Após uma segunda centrifugação, resuspenda a pelota em um mililitro de meio de cultura celular THP-1 para contagem, e ajustar a concentração celular para cinco vezes 10 para as quintas células por mililitro no meio de cultura celular THP-1. Remova a solução de bloqueio da segunda placa de 96 poços e adicione 100 microliters de células THP-1 a cada poço.
Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular. Ao final da incubação da opsonização, adicione 170 microliters de cultura parasita médio a cada poço da placa de opssonização, e sedimente os eritrócitos infectados até o fundo da placa por centrifugação. Lave os eritrócitos infectados opsonizados duas vezes com 200 microliters de cultura parasita por poço, usando uma pipeta multicanal para remover cuidadosamente o supernatante após a segunda lavagem.
Resuspend os eritrócitos infectados opsonizados em 100 microliters de meio de cultura celular THP-1 pré-aquecido por poço, e transfira 50 microlitadores de cada suspensão eritrócito infectado opsonizado para um poço correspondente na placa de fagocitose. Quando todas as células tiverem sido adicionadas, coloque a placa na incubadora de cultura celular por não mais do que 40 minutos, protegida da luz. No final da incubação, pare a fagocitose por centrifugação a quatro graus Celsius.
Remova o supernascer e resuspenja as pelotas com 150 microliters de solução de cloreto de amônio de temperatura ambiente por poço. Após exatamente três minutos, adicione 100 microlitadores de gelo frio a 2% FBS em PBS para parar a lise, e sedimentar as células intactas por centrifugação. Em seguida, lave as células três vezes com 200 microliters de gelo fresco frio 2% FBS em PBS por poço, por lavagem.
Após a lavagem final, resuspenja a pelota celular em 200 microliters de gelo fresco frio 2%FBS em PBS por poço. Para aquisição e análise da citometria de fluxo, carregue imediatamente as células em um citômetro de fluxo e use o gráfico de dispersão lateral linear para frente versus linear para os poços sem eritrócitos infectados para fechar as células THP-1. Adquira 10.000 eventos neste portão, e use as células THP-1 com os eritrócitos infectados opsonizados com um controle positivo para configurar um enredo histograma para medir a intensidade de fluorescência de brometo de ethidium.
Para análise, abra o gráfico de dispersão lateral linear para frente versus linear para os poços sem eritrócitos infectados, e portão as células THP-1. Em seguida, configure um portão positivo em um histograma FL-3 e copie esses portões em todos os outros poços de amostra para determinar a porcentagem de células THP-1 positivas do brometo de ethidium. Para cada amostra testada, a fagocitose pode ser relatada como o valor absoluto ou como a fagocitose relativa calculada como uma porcentagem usando o controle positivo como o máximo.
As células THP-1 devem ser verificadas periodicamente para a expressão da superfície do receptor gama FC por citometria de fluxo. As células devem ser negativas para CD16, e positivas para CD32 e CD64. Neste experimento de opsonização, as células THP-1 foram fechadas primeiro de acordo com seus perfis de dispersão dianteira e lateral, para permitir a quantificação da porcentagem de células rotuladas por brometo de etídio, indicativo de células que phagocitos têm fagocitos pelo menos um anticorpo opsonizado infectado eritrócito.
As amostras de controle negativo devem gerar um único pico negativo no canal FL3, com poucos eventos observados no marcador de brometo de ethidium. Assim, os valores médios da fagocitose, tanto como células thp-1 positivas de ethidium absolutos quanto como percentuais relativos de fagocitose, devem ser muito baixos. Em contraste, o controle positivo deve gerar traços com dois picos, um pico negativo e um pico claramente positivo e bem separado localizado dentro do marcador de brometo de ethidium.
Os valores médios da fagocitose são normalmente mais elevados para o controle positivo, seguidos pela piscina feminina exposta à malária e pelos controles femininos expostos à malária. Embora essa metodologia gere resultados consistentes, foram observados desvios no coeficiente de inclinação das linhas ajustadas. Portanto, recomenda-se o uso de valores relativos, especialmente se não for possível executar todas as amostras em um único experimento.
Certifique-se de planejar cuidadosamente o experimento com antecedência, preparando tanto as células THP-1 quanto os parasitas em conformidade, utilizando apenas trofócitos com uma pureza superior a 80%, certifique-se de incluir sempre os controles apropriados, para permitir que a qualidade do experimento seja avaliada e facilitar a análise dos dados.
