Desenvolvemos um microscópio de folha de luz que pode digitalizar toda a cóclea. Este microscópio tem objetivas montadas no ar com uma longa distância de trabalho que pode obter imagens de pequenas cócleas de camundongos até um grande osso temporal humano. Ele seciona a cóclea em série com um feixe de laser sem causar qualquer destruição mecânica.
Nosso método de imagem pode ser usado para avaliar alterações patológicas na cóclea, como a perda de células ciliadas e neurônios do gânglio espiral devido ao envelhecimento. Depois de eutanasiar e decapitar um rato, faça uma incisão dorso-ventral através do cérebro para hemisseccionar o crânio. Remova o cérebro e identifique a bula redonda na parte basoventral do crânio.
Abra a bula com rongeurs. Em seguida, visualize e remova a cóclea. Sob um microscópio de dissecção com aumento de cinco vezes, puncione a janela oval e remova o estribo com um palito afiado.
Em seguida, insira um palito na janela redonda para perfurar a membrana. Para realizar a fixação, cubra a janela redonda aberta com a ponta de corte de um conjunto de infusão que é anexado a uma seringa de um mililitro preenchida com dois mililitros de formalina. Infundir formalina lentamente através dos espaços perilinfáticos de uma cóclea durante um período de dois minutos, garantindo que a formalina está saindo da cóclea através da janela oval aberta.
Aparar o excesso de tecido da cóclea. Mergulhe em um frasco contendo 10% de formalina e coloque-o em um rotador durante a noite. Para descalcificação, enxaguar a cóclea em PBS três vezes por cinco minutos cada.
Imergir num frasco contendo solução a 10% de EDTA. Incubar por quatro dias com rotação, trocando a solução diariamente. Em seguida, perfundir a cóclea com PBS três vezes e mergulhar por 15 minutos entre as trocas para remover todo o EDTA.
Após a lavagem, desidratar a cóclea com concentrações crescentes de etanol por 30 minutos em cada concentração. Corar toda a cóclea por imersão em solução de rodamina B durante a noite com rotação. Retirar o excesso de corante da cóclea com duas trocas de etanol a 100% com incubação por cinco minutos para cada troca.
Transferir a cóclea corada para duas trocas da solução de Spalteholz por 30 minutos em cada troca. Deixe durante a noite na solução de limpeza com rotação. Fixar a cóclea a uma haste de amostra na extremidade oval e redonda da membrana da janela.
Certifique-se de que a solução de limpeza permanece dentro da cóclea e bolhas não são formadas. Fixe as extremidades ovais e redondas da cóclea molhada à haste seca da amostra usando cola ativadora UV. Cure a cola UV por 10 segundos movendo-se ao redor da cóclea com uma luz UV.
Suspender a cóclea na câmara de imagem em célula de fluorômetro de quartzo opticamente transparente preenchida com solução de Spalteholz com a haste da amostra conectada a um suporte rotativo que também está conectado ao estágio de translação X/Z. Em seguida, use um programa personalizado para mover a amostra através da folha de luz nas etapas do eixo X e Z e faça uma pilha de imagens 2D em toda a cóclea. Para processar a imagem, transfira a pilha de imagens para outro computador e carregue-a em um programa de renderização 3D para reconstrução e quantificação 3D.
A renderização direta do volume da cóclea de camundongo mostrou as janelas oval e redonda, órgão de Corti com células ciliadas, o canal de Rosenthal foi segmentado e o volume renderizado, e mostrou neurônios do gânglio espiral, ou SGNs, ao longo de sua extensão. Usando TSLIM, a cóclea de um camundongo jovem de três meses de idade e um camundongo de 23 meses de idade foram imageadas e contadas para SGNs. A contagem de células SGN em função da distância do canal de Rosenthal mostrada em um gráfico linear mostrou maiores SGNs no animal mais jovem nas extremidades média e apical da cóclea em comparação com o animal mais velho.
Essa aparente perda de SGNs foi visualizada utilizando-se análise de cluster e software de renderização 3D. As diferenças de densidade do SGN foram descritas em uma escala de cores onde os clusters de alta densidade são amarelos e o azul representa regiões de menor densidade. A análise de agrupamento mostrou claramente as regiões de menor densidade celular ao longo do comprimento do canal de Rosenthal.
A microscopia de folha de luz é projetada para produzir uma pilha bem alinhada de imagens a partir da qual renderizações de volume 3D de estruturas podem ser produzidas. Programas de renderização 3D permitem a avaliação quantitativa de estruturas e relações anatômicas entre diferentes estruturas. No entanto, como os programas de renderização 3D oferecem muitos parâmetros de usuário diferentes, há uma curva de aprendizado significativa para usar esses programas de forma eficaz.
